鸡蛋黄抗白细胞介素-8抗体、制备方法及其应用技术

一种鸡蛋黄抗白细胞介素（ＩＬ－８）抗体ｌｇＹ，是用下蛋母鸡作为生物反应器，用基因工程重组的白细胞介素－８免疫下蛋鸡，取出鸡蛋黄，用重蒸水制备鸡蛋黄匀浆，通过盐析方法沉淀鸡蛋黄中的抗体，经离子交换层析，获得纯化的鸡蛋黄抗ＩＬ－８抗体，该抗体具有中和ＩＬ－８活性的能力。鸡蛋黄抗ＩＬ－８抗体可应用于制备治疗牛皮癣外用冷霜制剂，临床使用结果显效和有效率达７６％，见效快，无副作用，使用方便。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及抗体及抗体药物，特别是涉及鸡蛋黄抗白细胞介素-8抗体及由其制造的抗体药物。所谓免疫是指外源抗原刺激引起动物个体状态改变的过程。动物对抗原刺激产生特异性反应称之为免疫应答，免疫应答的主要形式和结果之一是产生能与该免疫原(抗原)特异反应的抗体(林飞卿等，医学基础免疫学，1989，上海医科大学出版社)。抗体分子是称作免疫球蛋白(Ig)的蛋白质分子。传统上，哺乳类动物是产生抗体的主要来源。然而，大多数哺乳动物的免疫球蛋白除了能和产生该抗体的免疫原反应之外，还都能和细菌或哺乳动物的Fc受体相结合，并与链球菌蛋白A和链球菌蛋白G相结合，特别是哺乳动物IgG能与人体类风湿因子发生反应。鉴于上述诸多非特异性结合和反应的存在，哺乳类动物抗体在临床诊断和治疗方面的应用均存在着各种干扰作用。鸡在系统发育上与哺乳动物有很大差异。鸡的免疫球蛋白与哺乳动物的免疫球蛋白在免疫学特性上也有很大不同。鸡的免疫系统能识别更多的免疫反应位点和更多的抗原决定簇，因此鸡免疫系统对哺乳动物的蛋白或生物分子所产生的抗体有更高的效价和亲和能力。此外，鸡的免疫球蛋白不与细菌或哺乳动物Fc受体结合，链球菌蛋白A和链球菌蛋白G也不与鸡抗体(IgY)的Fc部份结合。在鸡中产生的抗体是对蛋白A或蛋白G专一性的，不是针对蛋白A/IgG或蛋白G/IgG的复合物。IgY也不与哺乳动物血液中的类风湿因子发生反应。因此，鸡免疫系统所产生的IgY对产生该抗体的免疫原具有较特异的反应，而较少与其他非特异分子的反应(Antal Rot et al.,J.Leukocyte Biology,59,1996January；Daniela Bruch-Gerharg et al.,J Exp.Med,184,2007 1996)。母鸡抵御外界病原体的能力以抗体的形式转输到鸡蛋中。在鸡蛋中，抗体免疫球蛋白分子主要贮存在鸡蛋黄中，鸡蛋清中抗体含量很低，(Anders Larsson et al.,Poultry Science,72,1807,1993)。因此，利用下蛋母鸡作为一个免疫反应器，将外源抗原蛋白注射给母鸡，所产生的特异针对外源蛋白抗原的抗体将被大量地输送到鸡蛋黄中储存。鸡蛋是众所周知的人类常用食品和化妆品原料，无论内服或外用对人体没有任何生物毒性和不良作用。因此，利用母鸡和外源抗原免疫的方法，可以从鸡蛋黄中生产制备大量具有临床应用价值的抗体药物。牛皮癣是一种皮肤的常见病多发病。在世界各国人群中的发病率约为1-2％，中国的牛皮癣病人约1千2百万以上。其发病的细胞和分子机理已在近几年中得到阐明。由于机体内在的遗传和外界的环境等综合因素，引起表皮角质化细胞过度增生而发生的皮肤疾病(Akita E.M.et al.,J.Food Science,57,629,1992)。表皮角质化细胞在各种因素刺激下可诱导和产生多种细胞因子，特别是白细胞介素-8(IL-8),IL-8是一种强烈的嗜中性白细胞化学趋向因子，能强力地募集和激活嗜中性白细胞。在外源或内源性的刺激下，多种细胞(包括单核细胞，巨噬细胞，T淋巴细胞，嗜中性粒细胞，成纤维细胞，角质化细胞等)会分泌过量的白细胞介素-8，使IL-8在皮肤局部的浓度高于正常水平。IL-8就会和携带IL-8受体的细胞表面受体结合，激活这些细胞，引起过度地增生。同时，被激活的细胞又大量分泌IL-8，募集全身的嗜中性细胞汇集到皮肤病灶部位，浸润和损伤正常皮肤，产生大量皮屑脱落，故又称之为银屑病。应用具有高特异性和中和活性的抗IL-8抗体，可以有效地中和及消除表皮中过量的IL-8，从而阻断或减少嗜中性白细胞的募集和浸润，达到治疗牛皮癣病灶，使表皮得以恢复正常的目的。如前所述，由于鸡的免疫系统对于来自哺乳动物的蛋白或生物分子比哺乳动物本身的免疫系统能识别更多的免疫反应位点和更多的抗原决定簇，鸡免疫系统对哺乳动物的蛋白或生物分子所产生的抗体有更高的效价和亲和能力。因此，如何制得鸡蛋黄抗IL-8抗体，并应用该抗体制造治疗牛皮癣的药物是个很有意义的工作。本专利技术目的是提供一种鸡蛋黄抗白细胞介素-8抗体IgY。本专利技术另一目的是提供鸡蛋黄抗白细胞介素-8抗体IgY的制备方法，是用基因工程重组白细胞介素-8免疫下蛋鸡，从鸡蛋黄分离纯化制得。本专利技术又一目的是提供鸡蛋黄抗白细胞介素-8抗体IgY的应用，用于制造治疗牛皮癣的药物。本专利技术鸡蛋黄抗白细胞介素-8抗体是用下蛋鸡为生物反应器，以基因工程重组IL-8为免疫原，免疫下蛋鸡后，从鸡蛋黄中分离纯化制得的抗体。本专利技术鸡蛋黄抗白细胞介素-8抗体IgY的制备方法如下1、用下蛋鸡为生物反应器，以基因工程重组IL-8为免疫原，多次免疫鸡，产生抗IL-8抗体。基因工程重组IL-8是加拿大YES生物技术公司产品，纯度＞98％。用福氏佐剂配制的IL-8溶液多点皮下注射免疫下蛋鸡，每两周免疫一次，共五次，末次免疫后两天可收集鸡蛋，一个月后，再用IL-8作回忆刺激，加强鸡对外源免疫原的反应，继续收集鸡蛋。2、从鸡蛋黄分离纯化抗IL-8抗体IgY从鸡蛋获取的蛋黄，可冻存于-80℃冰箱中，长期备用，以供分批制备鸡蛋黄抗IL-8抗体IgY。蛋黄用适量重蒸水搅成匀浆，4℃放置几小时后，离心分离获得上清液，上清液含包括鸡抗体的可溶性蛋白质。用盐析(19％硫酸钠)方法，沉淀鸡免疫球蛋白，沉淀重溶于重蒸水中，再用盐析(14％硫酸钠)方法沉淀鸡免疫球蛋白，溶于重蒸水后，用离子交换层析分离纯化得鸡蛋黄抗IL-8抗体IgY。纯化的抗IL-8抗体，在SDS-PAGE中显示符合IgY特征的59.5kd的重链分子和26kd的轻链分子条带。用免疫印迹方法证实，本专利技术抗IL-8抗体，只和IL-8分子显示免疫反应，和其他生长因子，细胞因子无免疫反应，说明鸡蛋黄抗IL-8抗体的专一性和特异性。用细胞学方法测定其对IL-8的中和作用。在IL-8作用下，嗜中性白细胞被诱导产生明显迁移运动，而当加入纯化的鸡蛋黄抗IL-8抗体后，因为其对IL-8的中和活性，而阻断了IL-8对嗜中性白细胞的化学趋向作用。因此鸡蛋黄抗IL-8抗体可应用于制造治疗牛皮癣的抗IL-8抗体外用冷霜制剂。冷霜制剂中治疗牛皮癣的有效药物成分是鸡蛋黄抗IL-8抗体，辅助成份是冷霜原剂。两者的含量配比是每50克冷霜制剂中含有有效药物抗IL-8抗体量20mg。一般外用药物常用的各种冷霜原剂都能适用于本专利技术，下面的冷霜原剂的组成是本专利技术的一个实例，冷霜原剂的成分为三乙醇胺/甘油/硬脂酸/白凡士林/液体石蜡/单硬脂酸甘油酯/月桂醇硫酸钠/尼泊金乙酯/重蒸水。在预先制备好的冷霜原剂中，按每500g冷霜制剂中加入200mg抗IL-8抗体的比例加入纯化的抗体，充分搅拌混匀，即成冷霜制剂，分装保存于4℃，长期备用。应用本专利技术制备的鸡蛋黄抗IL-8抗体配制成的治疗牛皮癣的外用冷霜制剂进行临床治疗效果观察，将抗IL-8抗体外用冷霜每天三次涂于牛皮癣患处皮肤，以药物使用一月内明显止痒，渗出液减少，皮屑减少，三个月后皮肤无皮屑，干燥光滑，无症状为显效。以药物使用一月后明显止痒，渗出液减少，三个月后皮肤不痒，皮屑明显减少，皮肤逐渐光滑，基本无明显症状为有效在治疗牛皮癣患者25例中，显效为8例，有效为11例，无显本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡蛋黄抗白细胞介素－８抗体，其特征在于它是用基因工程重组白细胞介素－８免疫下蛋鸡，从鸡蛋黄中分离纯化制得的抗体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐永华，叶庆炜，
申请(专利权)人：徐永华，叶庆炜，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]