一种增强多肽在体内稳定性的方法及其应用技术

一种增强多肽在体内稳定性的方法及其应用，本发明专利技术是利用有机化学原理将多肽与人血白蛋白在体内或在体外相连的方法，从而增强多肽在体内的稳定性。该方法包括在体外将由５～１００个氨基酸组成的多肽用特殊的化学分子修饰。修饰后的多肽保持原多肽的生物学活性，并能在体内或体外与人血白蛋白以共价的方式连接，以达到延长多肽在体内的半衰期，提高生物利用度。本发明专利技术具有工艺简单，可以根据需要选择在体内或体外实现多肽与人血白蛋白的结合，并且结合过程中没有修饰多肽以外的其它反应产物生成。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及利用有机化学原理将多肽与人血白蛋白在体内或在体外相连的方法，从而增强多肽在体内的稳定性。本专利技术所涉及的多肽可以是从天然或合成多肽中得到的活性部分，具有潜在的治疗作用，有重要的药物开发价值。这些治疗作用可以是直接的，也可以是间接的，包括用于预防、涉及疫苗、药物设计等。这些具有生物学活性的多肽可以是人机体中自然产生的、或者重组合成的、或者是这些多肽的分子异构体。例如多肽酶、酶抑制剂、抗原、抗体、多肽激素、细胞因子、促红细胞生成素、干扰素、白细胞介素、等等；他们可以是整个分子，也可以只是一部分；还可以是能与这些多肽的细胞受体结合的其他多肽分子，如从随机多肽文库中筛选出的具有特异生物活性的多肽分子。本专利技术所涉及具有生物学活性的多肽也可以不是人源的，可以是从动物中、细菌中、真菌中、或者植物中提取的，或者完全人工合成的蛋白多肽的全部或部分。
技术介绍
许多肽类尤其是小分子多肽具有治疗活性但不能开发成药物。原因有多种，包括在体内不稳定、结构不稳定、难以大批量制备等。许多多肽在体内未产生预期的效果是由于给药剂量、方式和药代等问题造成的。本专利可以解决这些问题。多肽与人血白蛋白相连而不破坏多肽的结构和生理功能，但在体内的稳定性可以得到增强，从而达到延长多肽在体内的半衰期，提高生物利用度。本专利技术基于这样的发现，人血白蛋白在血清中具有高半衰期，它能提高多肽在血清中的半衰期，使活性维持更长，能更有效地使多肽到达作用位置，从而可以降低多肽的使用剂量，提高药效，减少副作用。另外，小分子多肽没有或只有较弱的抗原性，比大分子蛋白有更大优势。已有提到用基因工程的方法制备多肽与人血白蛋白的融合蛋白，从而增强多肽在体内的半衰期的报道(美国专利5,876,969)。延长药物在体内的半衰期，提高生物利用度、方便临床用药一直是制药公司和许多药物研究单位进行药物开发的主要方向之一。大分子药物，如蛋白类、DNA及RNA类生物技术产品药物难于经口服途径给药，因为这类大分子很容易经胃肠道降解，因而这些药物多数情况须经皮下、肌肉、静脉或局部注射给药。但由于任何药物在血液中仅停留一定时间，所以大分子药物必须反复注射以保持一定的血浆浓度，从而给临床应用造成很多不变，尤其是许多生物药物均须终生用药。目前研究最多的延长药物体内半衰期的方法有两种。一种是改变制剂组成，通常使用多聚体(Polymer)包埋药物或与药物交联，用得最多的多聚体就是聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)；另一种方法就是生产一种体内可以进行控制药物释放的医疗装置。已有PEG交联的生物药物在美国上市，如PEG干扰素，还有许多用PEG包埋的药物正在进行临床试验，如InfiMed Therapeutic公司(Cambridge，MA)的InfitropinCR，即长效生长激素(Growth Hormone)。另外，也有许多能控制释放的医疗装置的临床试验接近完成，如GenetronicBiomedical公司(San Diego，CA)的MedPulser电穿孔系统。然而，鉴于上述两种方法的不完善及复杂性，寻找更好的延长多肽药物体内半衰期的方法将具有极高的开发价值和市场前景。本专利技术利用化学方法使多肽特异性地与人血白蛋白相连，工艺简单，可以根据需要选择在体内或体外实现多肽与人血白蛋白的结合，并且结合过程中没有修饰多肽以外的其它反应产物生成。如前所述，本专利技术所涉及的多肽特指由5-100个氨基酸所构成的短多肽。多数酶，或酶的抑制剂，或抗原、或抗体、或激素、或干扰素、或细胞因子、或生长因子、或分化因子等的活性中心均由少于100个氨基酸的多肽构成。另外，由于所有蛋白质均由20种不同的氨基酸组成，所以，不同的氨基酸组合可以构成任何空间结构已实现功能的多样性。由随机的氨基酸组合所得到的多肽随机文库的多样性远远地超出了目前已知的化学物质文库的多样性，而且多肽本身的可朔性也较小分子化合物为好，所以，用小分子多肽文库在一些情况下替代小分子化合物文库也为药物筛选开辟了一条新的路线。与蛋白质药物和小分子药物一样，小分子多肽药物也可以通过多种方法来增强其体内的稳定性、提高血浆半衰期，如脂质体包埋、缓释装置、以及利用重组DNA技术与其他生物稳定性蛋白(如抗体Fc段，或人血自蛋白)相连。这些方法可以解决多数药物的体内稳定性问题，但存在操作复杂或者有潜在的免疫反应的危险。本专利技术所涉及的多肽可以是利用重组DNA技术于大肠杆菌中表达产生的；也可以是利用化学方法人工合成的。在大肠杆菌中表达时，将编导靶多肽的重组DNA克隆入适当的表达载体中，该重组DNA可以利用经典方法人工合成，也可以利用多聚酶链反应(PCR)方法获得。将含有靶多肽重组DNA的表达质粒导入适当的宿主大肠杆菌中，经表达、纯化获得靶多肽。应用化学方法人工合成多肽时，可以应用自动的固相多肽合成仪或应用标准的手工合成方法进行。已知的自动固相多肽合成仪可以是由Applied Biosystems公司生产；也可以由其他相当的厂家生产。标准的手工多肽合成方法利用了t-butyloxycarbonyl(t-BOC)或9-fluorenylmethyloxycarbonyl(FMOC)对氨基酸α-氨基的保护作用，将单个氨基酸从C-段开始一步一步加上，然后再经脱保护，并将合成好的多肽从与其连接的固相上切下，经系列脱盐、萃取、纯化等步骤获得多肽。小分子多肽在免疫学实验室中应用一直十分广泛。例如可以用于T细胞和B细胞的表型分析，以及与其他免疫增强剂或蛋白结合后用于免疫动物易产生抗体。近几年由于人类基因组计划的进展，人们对多肽的认识与日俱增，小分子多肽的应用也更加广泛，小分子多肽药物的开发于治疗性单克隆抗体的开发一样，成为许多制药公司的重要研究方向之一。例如SCIOS公司(Sunnyvale，CA)的Natrecor，即B型利尿肽(B-type natriuretic peptide，BNP)，目前已完成III期临床试验，等待药审机构最后的批文。该药为特效的治疗急性充血性心衰的小分子多肽药物。下表(表一)列出了几种具有代表性的治疗多肽的大小、功能及序列表一.几种具有代表性的治疗多肽 小分子多肽具有很好的治疗活性但又有其明显的缺陷，即在体内不稳定、结构不稳定，因而极易被降解产生给药剂量、方式和药代等问题。本专利技术通过多肽与人血白蛋白在体内或体外自然条件下相连来实现增强多肽在体内稳定性，并达到提高治疗作用的目的。这种连接均在温和条件下或体内进行，连接后的多肽保持其原有功能，人血白蛋白也按正常途径进行代谢。本
技术实现思路
技术方案要点包括以下步骤将多肽溶解在10-200mmol/Lol/L的磷酸盐缓冲液中，缓冲液的pH值为6-9，缓冲液可以是HEPES，也可以是碳酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，还可以是硼酸盐缓冲液。对一些疏水性较强而造成溶解度较差的多肽，还可以加入一些诸如非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或变性剂的助溶剂，如吐温20、吐温60、吐温80、Triton、十二烷基硫酸钠、尿素或盐酸胍等。这些缓冲液实例并不以任何方式限制在本专利技术中应用其他缓冲液。将修饰用化学分子溶解在10-200mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中，缓冲液的pH值为6-9，缓冲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增强多肽在体内稳定性的方法，该方法是指先在体外将多肽用化学分子修饰：即将多肽溶解在１０－２００ｍｍｏｌ／Ｌ的盐类缓冲液中，再将修饰用化学分子溶解在１０－２００ｍｍｏｌ／Ｌ的溶液中，将溶解后的化学分子加入多肽溶液中，在室温下反应３０－６０分钟或在４℃下反应２－２０小时，也可以在３７℃反应２０－４０分钟；将上述反应混合液通过脱盐柱，用盐类缓冲液洗脱，收集洗脱的多肽进行冷冻干燥或不冷冻干燥；并且在体外使修饰后的多肽直接加入含有５－２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ的人血白蛋白的溶液中，在室温下反应３０－６０分钟或在４℃下反应２－２０小时，也可以在３７℃反应２０－４０分钟，反应终止时加入终浓度３０－２００ｍｍｏｌ／Ｌ含有自由巯基的化合物或者含有自由氨基的化合物，与人血白蛋白以共价键的方式相连；在体内以静脉注射或局部注射的方式使修饰后的多肽与人血白蛋白以共价键的方式相连。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：娄竞，苏冬梅，
申请(专利权)人：沈阳三生制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]