本发明专利技术公开了一种抗ＳＡＲＳ冠状病毒的卵黄抗体及其制备方法和液体制剂。本发明专利技术主要以健康产卵的母鸡为免疫动物，利用基因工程的方法重组基因蛋白Ｓ、Ｍ或Ｅ作为抗原；或特选代表ＳＡＲＳ冠状病毒的Ｓ蛋白或Ｍ蛋白或Ｅ蛋白的抗原表位，利用多肽合成仪合成Ｓ、Ｍ或Ｅ的多肽作为抗原，或偶联后作为抗原；或野生型毒株全病毒灭活后作为抗原，通过初次免疫、加强免疫、收集鸡卵并从卵黄中提取抗ＳＡＲＳ冠状病毒的卵黄抗体，该抗体还可制成液体制剂。本发明专利技术的抗ＳＡＲＳ冠状病毒的卵黄抗体及其液体制剂可用于预防因ＳＡＲＳ冠状病毒引起的严重急性呼吸综合征。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗SARS冠状病毒的卵黄抗体及其制备方法和液体制剂。
技术介绍
2002年11月份开始在我国广东地区出现的以发热、肺部感染为特征的疾病，国际上称为严重急性呼吸综合征(Severe Acute RespiratorySyndrome，简称SARS)。截止2003年5月26日止，全球已有31个国家发现了SARS病例，全球累计病例数达到8202例，我国内地有25个省市自治区有该病流行，累计病例数达到5316例。该病的流行对各国的经济和社会稳定都产生了非常严重的影响。SARS病毒属于冠状病毒科，病毒粒子多呈圆形，有囊膜，外周有冠状排列的纤突，病毒直径在80-120nm之间。该病毒散在分布于细胞浆中，呈圆形，直径多在90nm左右。感染病毒的细胞线粒体肿胀，部分线粒体外膜或嵴溶解。SARS冠状病毒为单链单节段(+)RNA病毒，全长29.725kb，具有11个ORF(Open Reading Frames)，分别编码依赖于RNA的RNA聚合酶、4种结构蛋白(S，E，M，N蛋白)、5种未知蛋白，与其它宿主来源冠状病毒的序列比较，进化分析，呈一单独的分支。该病毒在增殖过程中虽没有逆转录过程，但RNA聚合酶没有矫正机制，变异较大，现已知SARS病毒至少有6个变种。这给治疗SARS带来了巨大困难。经过序列测定并比较，SARS病毒基因组与其他冠状病毒的结构相似。SARS病毒基因组初步的基因组注释在NCBI(Genebank Accession No.NC 004718)完成，预测得到的主要蛋白质有RNA聚合酶蛋白(聚合酶1a，1b)，S蛋白(spike protein)，M蛋白(matrix protein)，N蛋白(nucleocapsidprotein)、E(small envelope protein)蛋白等。SARS的流行病学特点及临床过程与以往的冠状病毒感染有极大的不同，大多数SARS发生在青壮年。SARS的最常见的传染途径为密切接触，包括传染性的飞沫以及直接与传染性体液接触。截至目前，人们还没有找到很好的预防和治疗SARS病毒的方法。目前常用的预防SARS病毒的消毒剂主要有含氯消毒液和过氧乙酸消毒剂，以及最新研发出来的新型的含溴消毒剂，这些消毒剂尽管可以有效的杀灭冠状病毒，但同时它们对人体有比较强烈的刺激性和腐蚀性，因此只能用于日常物品的消毒，无法对人体进行消毒保护。在治疗SARS方面，目前人们还没有非常好的治疗手段，基本上都是针对出现的体征，进行对症治疗。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题之一是克服现有技术上的不足，提供一种方便、高效、无毒副作用、可对人体进行消毒的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体。本专利技术所要解决的技术问题之二是提供一种所述抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法。本专利技术所要解决的技术问题之三是提供一种使用方便的可预防和治疗SARS冠状病毒引起的严重急性呼吸综合征的液体制剂。本专利技术所采用的技术方案是一种抗SARS冠状病毒的卵黄抗体，它按照非变性聚丙烯凝胶电泳进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现单一条带，Western Blotting检测可以在分子量约170～190KD处发现一条单一的特异性酶染条带；或按照变性聚丙烯凝胶电泳进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现两条条带，Western Blotting检测可以在分子量约65KD和25KD处发现两条特异性酶染条带；采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度为0.5～20mg/ml；经过酶联免疫吸附实验测定其效价为1∶50-1∶100000。所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法，它包括以下步骤(1)、制备单一抗原或复合抗原①、基因重组法利用基因工程的方法，构建含有SARS冠状病毒的S蛋白、M蛋白、E蛋白的表达质粒，在大肠杆菌宿主中进行表达，然后分离并纯化表达产物作为单一蛋白抗原；取上述分离纯化后的表达产物二种或二种以上进行组合可得所述的复合蛋白抗原。②、多肽合成法利用多肽合成仪合成SARS冠状病毒S蛋白或M蛋白或E蛋白的以下任一抗原表位的多肽，作为单一多肽抗原。所述S蛋白的抗原表位分别为PepS1(dvqapnytqhtssmrg)PepS2(stgnynykyrylrhgklrp)PepS3(psskrfqpfqqfg)PepS4(vrdpktseildispc)PepS5(aaeqdrntrevfa)PepS6(lpdplkptkrsfi)PepS7(psqernfttapaic) PepS8(peldsfkeeldk)PepS9(qelgkyeqyikwp)PepS10(snfrvvpsgdvvrfp)PepS11(ctdvstaihadqltpa)PepS12(keeldkyfk nhtspdvd)所述M蛋白的抗原表位分别为PepM1(madngtitveelkq)PepM2(ysnrnrflyiik)PepM3(artrsmwsfnpetn)PepM4(aviirghlrmaghslgrc)PepM5(gasqrvgtdsgf)PepM6(nyklntdhagsndniallvq)所述E蛋白的抗原表位分别为PepE1(mysfvseetgt)PepE2(vkptvyvysrv)PepE3(knlnssegvpdllv)任取上述21种单一多肽抗原中的二种或二种以上进行组合可得所述的复合多肽抗原。③、多肽抗原偶联法其步骤是，a、取1mg KLH或BSA于1.5ml离心管中，用100μl的PH10.0硼酸缓冲液充分溶解，10000rpm离心1分钟，将上清转移到干净的离心管； b、称上述方法②制得的22个抗原表位之一的多肽1μmol，用100μl的pH10.0硼酸缓冲液溶解；c、将步骤a制得的KLH或BSA溶液逐滴加到多肽溶液中；d、边震荡边缓慢加入新鲜配制的0.3％戊二醛溶液0.1ml，室温作用2小时，中间倒转试管数次；e、加入1M甘氨酸25μl，反应30min；f、以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜，换液一次，继续透析不少于4小时。按上述步骤对方法②制得的21个抗原表位的多肽偶联后的抗原作为单一多肽抗原，任取上述二种或二种以上单一多肽抗原进行组合可得所述的复合多肽抗原。④、野生型毒株全病毒灭活法a、SARS冠状病毒的培养取新鲜的SARS冠状病毒悬液，接种于Vero E6细胞，在33～35℃的CO2培养箱内培养5～9天后，收集病变细胞的上清液。b、SARS冠状病病毒的灭活向步骤a所制得的病毒上清液中，加入甲醛溶液使其终浓度为0.1～3％，37℃作用24～96小时，使SARS冠状病毒完全灭活。c、SARS冠状病毒的浓缩将经过步骤b灭活的病毒悬液超滤后得到浓缩的灭活SARS冠状病毒。按照上述步骤所得到的灭活的SARS冠状病毒作为单一抗原。(2)、制备抗体①、佐剂的选用 初次免疫选用弗氏完全佐剂与所述单一抗原或复合抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为免疫抗原；所有的加强免疫均选用弗氏不完全佐剂与所述单一抗原或复合抗原重量比为1∶1混合乳化后作为免疫抗原。②、对产卵母鸡的免疫及取卵选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述免疫抗原，此为初次免疫，隔2周后开始加强免疫，以后每隔一周加强免疫一次，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗ＳＡＲＳ冠状病毒的卵黄抗体，其特征在于：它按照非变性聚丙烯凝胶电泳进行检测，经过考马斯亮蓝Ｒ２５０染色后，图谱呈现单一条带，Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测可以在分子量约１７０～１９０ＫＤ处发现一条单一的特异性酶染条带；或按照变性聚丙烯凝胶电泳进行检测，经过考马斯亮蓝Ｒ２５０染色后，图谱呈现两条条带，Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测可以在分子量约６５ＫＤ和２５ＫＤ处发现两条特异性酶染条带；采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度为０．５～２０ｍｇ／ｍｌ；经过酶联免疫吸附实验测定其效价为１∶５０－１∶１０００００。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：叶志海，丁波，王文，夏鲁全，
申请(专利权)人：珠海百奥生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]
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