乳铁传递蛋白制造技术

本发明专利技术公开了纯的每分子含有不多于２个金属离子的乳铁传递蛋白多肽或者含有该多肽及其片段的混合物。该多肽或该混合物能刺激骨骼生长和抑制骨吸收。同时本发明专利技术还公开了利用该多肽或该混合物治疗与骨骼相关的病症的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求申请号为518121、申请日为2002年4月3日的新西兰申请的优先权，本文引用其内容作为参考。
技术介绍
乳铁传递蛋白是一种80KD的铁结合糖蛋白，存在于包括眼泪、胆汁、支气管粘液、胃肠液、子宫颈-阴道粘液、精液及乳汁在内的大多数外分泌液中。它是循环中多型核中性粒细胞次级特异颗粒的主要成分。乳铁传递蛋白最丰富的来源是哺乳动物的乳汁和初乳。乳铁传递蛋白在循环中的含量为2-7μg/ml。它可能具有多种生物学功能，包括铁代谢、免疫功能及胚胎发育的调节等。乳铁传递蛋白对包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、酵母及真菌在内的多种病原体具有抗微生物活性。乳铁传递蛋白的抗微生物作用源于其与病原体生长必需的铁的结合能力。乳铁传递蛋白还能抑制多种病毒的复制并可通过与细菌膜上脂多糖的脂质体A成分结合来增加某些细菌对抗生素的敏感性。专利技术概述本专利技术涉及具有刺激骨骼生长和抑制骨吸收作用的乳铁传递蛋白多肽。特别地，本专利技术涉及每分子含有不多于2(即0、1或优选2)个金属离子的纯的乳铁传递蛋白多肽。“纯的”多肽指不含有其它生物大分子的多肽并且其在干重时的含量至少为65％(例如，至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％)纯度。可通过任何适合的标准方法来检测多肽的纯度，例如通过柱层析、聚丙烯酰氨凝胶电泳或HPLC分析。此乳铁传递蛋白多肽可以是自然产生的多肽、重组多肽或合成的多肽。保持野生型乳铁传递蛋白多肽生物学活性的野生型乳铁传递蛋白多肽的变体(例如含有至少2(例如4、6、8、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700)个氨基酸的野生型乳铁传递蛋白多肽片段或含有乳铁传递蛋白多肽序列的重组蛋白)也在本专利技术的范围内。本专利技术中的乳铁传递蛋白多肽可以是哺乳动物来源的，例如来自人或牛的乳汁。与多肽结合的金属离子可以是铁离子(如自然产生的乳铁传递蛋白多肽中)、铜离子、铬离子、钴离子、锰离子、锌离子或镁离子。本专利技术中的乳铁传递蛋白多肽可用于刺激骨骼生长(例如，通过促进成骨细胞和软骨细胞的增殖)和抑制骨吸收(例如，通过抑制破骨细胞的生长)。本专利技术制备的乳铁传递蛋白多肽(例如，从牛奶中分离的乳铁传递蛋白)可包括单一种类的多肽，例如每分子结合2个铁离子的多肽。其还可包含不同种类的多肽，例如其中一些分子不结合离子而其它分子每分子结合1个或2个离子；一些分子结合铁离子而其它分子结合铜离子；一些分子是含0、1或2个金属离子的具有生物活性的乳铁传递蛋白多肽(全长或短于全长)而其它分子为该多肽的片段(相同或不同)；或所有分子为含0、1或2个金属离子的全长乳铁传递蛋白多肽的片段(相同或不同)。例如，全长乳铁传递蛋白多肽和全长乳铁传递蛋白多肽的各种片段的混合物可从全长乳铁传递蛋白多肽的水解产物，例如诸如蛋白酶消化的不完全消化产物中制备。或者，该混合物可通过将全长乳铁传递蛋白多肽与其各种片段(例如，合成片段)混合来制备。另一方面，全长乳铁传递蛋白多肽的各种片段的混合物，也可通过例如全长乳铁传递蛋白多肽的完全消化(即消化后没有全长多肽存在)或全长乳铁传递蛋白多肽的不同片段的混合来制备。本专利技术还涉及一种营养(nutraceutical)组合物，其可以是乳汁、果汁、饮料、快餐或食品补充剂(dietary supplement)。该营养组合物含有高于自然含量的本专利技术乳铁传递蛋白多肽或该多肽与其片段的混合物。已发现乳铁传递蛋白可刺激成骨细胞和软骨细胞的增殖并抑制破骨细胞的生长。因此，本专利技术中的营养组合物可用于预防和治疗诸如骨质疏松、类风湿或骨性关节炎的骨性病症。该营养组合物还可包括适当含量的另一种诸如钙、锌、镁维生素C、维生素D、维生素E、维生素K2或其混合物的骨增强成分。此外，本专利技术还涉及一种药物组合物，含有本专利技术的乳铁传递蛋白多肽或该多肽与其片段的混合物以及药物可接受的载体。可选择地，该药物组合物还可包含其它骨增强剂。本专利技术还涉及上述乳铁传递蛋白多肽或该多肽与其片段的混合物在生产预防和治疗骨性疾病的药物方面的用途。本专利技术提供了预防和治疗骨相关病症的方法(例如通过刺激骨骼生长和抑制骨吸收)。该方法包括给予个体其所需有效剂量的本专利技术的乳铁传递蛋白多肽或该多肽与其片段的混合物。该方法还包括同时给予该个体有效剂量的另一种骨增强剂。本专利技术中一个或多个实施方案的详细描述如下所述。本专利技术的其它特征、目的和优点可从详细描述和权利要求中得出。详细描述本专利技术是基于意外发现的乳铁传递蛋白刺激成骨细胞和软骨细胞增殖并抑制破骨细胞生长的特性。因此，乳铁传递蛋白可用于预防和治疗骨性病症。本专利技术的乳铁传递蛋白多肽是纯的每分子含有不多于2个金属离子的多肽。事实上，制备的乳铁传递蛋白的离子/乳铁传递蛋白比值的检测表明其比值可在0-2.5范围。其可从天然来源(例如哺乳动物乳汁)中分离得到或利用本领域所属技术人员公知的遗传工程或化学合成技术生产。以下就是从牛奶中分离乳铁传递蛋白的示范步骤4℃下以5ml/min流量，使新鲜的脱脂乳汁(7L，pH6.5)通过用超纯水(milli Q water)平衡的300ml的S Sepharose Fast Flow柱。用2.5倍床体积的水冲洗除去未结合蛋白，并用约2.5倍床体积的分别为0.1M、0.35M和1.0M的NaCl将结合蛋白逐步洗脱。收集1M NaCl洗脱所得的粉红乳铁传递蛋白条带作为单一组分，并用milli Q水透析随后冻干。将该冻干粉溶解在25mM、pH6.5磷酸钠缓冲液中，并在S Sepharose FastFlow柱中，以3ml/min流量、使用NaCl浓度梯度到1M的上述缓冲液再层析。经过凝胶电泳和反向HPLC分析，将含足够纯度的乳铁传递蛋白的组分合并在一起，透析并冻干。在pH8.6、含0.15M KCl的80mM磷酸二钾溶液中，通过在Sephacryl 300上进行凝胶过滤得到最终的乳铁传递蛋白纯品。合并所选择的组分，用milli Q水透析并冻干。HPLC分析结果和乳铁传递蛋白的铁离子饱和形式的光谱比值(280nm/465nm)为～19或更低的事实表明该制备所得的乳铁传递蛋白纯度大于95％。通过在pH7.8含1％纯化乳铁传递蛋白的50mM Tris、10mM碳酸氢钠溶液中以摩尔比1∶2加入过量的5mM次氮基三乙酸铁(ferricnitrilotriacetate)可实现乳铁传递蛋白的铁离子饱和(Foley and Bates(1987)Analytical Biochemistry 162，296-300)。在4℃下，用100倍体积的milli Q水(更新两次)透析20小时，以除去过量的次氮基三乙酸铁。然后将该铁离子负载的(holo-)乳铁传递蛋白冻干。在4℃下，使用30倍体积的pH2.3含0.1M柠檬酸和500mg/L EDTA二钠的溶液，对1％的高度纯化乳铁传递蛋白样品的水溶液透析30小时，从而制备去除铁离子的(apo-)乳铁传递蛋白(Massons and Heremans(1966)Protides of the Biological fluids 14，115-124)。用30倍体积的milli Q水(更新一次)透析除去柠檬酸盐和EDTA，并将得到的无色溶液冻干。本专利技术中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯的每分子含有不多于２个金属离子的乳铁传递蛋白多肽，其中所述多肽能刺激骨骼生长和抑制骨吸收。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊林科尼什，伊恩雷金纳德里德，凯帕特丽夏帕尔马托，尼尔沃德哈格特利，
申请(专利权)人：方塔拉研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：NZ[新西兰]