聚乙二醇修饰重组人白介素及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种聚乙二醇修饰重组人白介素及其制备方法。其特征是重组人白介素上连接有一条、二条或者二条以上的聚乙二醇链。本发明专利技术的聚乙二醇修饰的重组人白介素具有白介素的生理活性，而稳定性优于白介素，它的血浆清除率低，体内半衰期长，可用于制备抗病毒、抗癌等药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种白介素，具体地说是一种聚乙二醇修饰的白介素。
技术介绍
生物技术的迅速发展，促进了蛋白质(酶)类药物的生产与应用。然而由于外源蛋白质属于天然抗原，具有较强的免疫原性，会引发抗体的产生，还会受到各种蛋白酶的攻击而失去生物活性。还有些药物半衰期过短(尤其是小分子蛋白质)，而无法充分发挥其生物功能。这些已成为制约蛋白质药物发展的关键因素。因此研究人员采用了各种药物传递技术来提高蛋白质药物的疗效，包括采用不同的给药途径(如口服，鼻腔给药，透皮吸收)，不同的载体(如微球，脂质体，红细胞，单克隆抗体)，不同高分子材料(如多糖)修饰，不同药物释放技术(如控释缓释技术，前药)。而研究最为广泛的就是聚乙二醇修饰技术。研究表明，蛋白质药物经PEG修饰后，增加了溶解度和稳定性，减弱或消除了免疫原性、抗原性和毒性，改善了药动学性质，增加了体内的半衰期，增加了治疗指数，扩大了临床应用。修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等类型，对蛋白质的氨基、巯基和羧基等侧链基团进行化学修饰。其中，氨基(主要为赖氨酸的ε-氨基及N末端的α-氨基)具有较高的亲核反应性，因而是最常被修饰的基团。。重组人白介素-2具有促进T淋巴细胞增殖，激活淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)，促进β-干扰素的产生等功能，对免疫应答的产生和调节有重要作用，是目前免疫疗法中重要的细胞因子，但存在半衰期短，反复注射易引起免疫反应等问题，限制了其临床应用。Knauf等最先对重组人白介素-2的氨基进行了PEG修饰研究，表明PEG-IL-2半衰期增加了20倍。定点修饰研究也陆续有报道。在临床研究方面，已完成了I期临床和II期临床，临床研究显示出良好的抗肿瘤活性，无中和抗体的产生，半衰期增加了10-20倍。目前正在进行III期临床。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是公开一种，以满足医药领域发展的需要。本专利技术的具体的技术方案如下一种聚乙二醇修饰的重组人白介素，其特征在于，重组人白介素上连接有一条、两条或者两条以上的聚乙二醇链，其结构通式如下PEG-rhIL其中PEG代表聚乙二醇，rhIL代表重组人白介素；优选重组人白介素-2，优选的聚乙二醇修饰的重组人白介素结构通式如下PEG-rhIL-2； PEG连接在重组人白介素-2的氨基上。所说的聚乙二醇链的分子量为2000-20000。本专利技术的聚乙二醇修饰的重组人白介素的制备方法包括如下步骤将硼砂缓冲液加入重组人白介素溶液，调节其pH值至6.0-9.0，然后加入碳酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯在0-25℃下进行反应，反应时间不少于15分钟，一般为15～60分钟，将反应混合液用Sephacryl S-200进行色谱分离，流动相为含氯化钠的醋酸缓冲液，色谱分离可得聚乙二醇修饰的重组人白介素；所说的重组人白介素溶液为重量浓度为1mg/ml的水溶液；碳酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯与重组人白介素的摩尔比为碳酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯∶重组人白介素＝1∶1～20；上述的Sephacryl S-200为一种凝胶过滤介质；流动相中氯化钠的摩尔浓度为0.25M，醋酸缓冲液的pH值为3.6～5.8；本专利技术的聚乙二醇修饰的重组人白介素可用于制备抗病毒和抗肿瘤药物。本专利技术的聚乙二醇修饰的重组人白介素能够保留较高的抗病毒活性，同时它与未修饰的重组人白介素相比，免疫原性降低，热稳定性和酶稳定性增加，体内半衰期长，血浆清除率低，因此作为抗病毒、抗肿瘤等药物，它比未修饰的重组人白介素有更大的优越性。本专利技术的聚乙二醇修饰的重组人白介素的制备方法简单易行。附图说明图1为PEG-IL-2反应液及分离产物的SDS-PAGE图(银染)。具体实施例方式实施例1碳酸单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(SC-mPEG)的制备称取14.4g单甲氧基聚乙二醇12,000，三光气0.56g，溶于甲苯20ml和二氯甲烷12ml中，逐滴加入无水三乙胺1ml，搅拌反应过夜。将反应液抽真空，挥去大部分溶剂，将所得残渣重新溶解于甲苯8ml和二氯甲烷10ml中。加入N-羟基琥珀酰亚胺0.21g，取三乙胺0.3ml，用二氯甲烷3ml稀释，逐滴加入反应液中，继续反应完全后，将反应液过滤并抽真空，所得残渣溶解于50℃乙酸乙酯60ml中，过滤，冷却后所得结晶即SC-PEG粗品。将所得产物用乙酸乙酯反复重结晶。测定产品的红外光谱，有如下特征峰1812，1789(C＝O，琥珀酰亚胺)；1742(C＝O，羧基)；1114(CH2OCH2)。测定产品的核磁共振光谱(H-NMR，CDCl3)，有如下特征峰4.35(m，4H，CH2OCO2)；3.55(s，～500H，PEG)；2.74(s，8H，CH2C＝O)。实施例2SC-PEG对白介素-2的修饰条件的选择反应时间的选择取4支1.5ml Eppendorf管，每管加入白介素-2浓缩液0.5ml(2.0mg/ml)，再加入等体积0.05M的pH值为8.0硼砂缓冲液，混匀后再分别加入6.0mg的SC-PEG，反应15min、30min、1h、2h后终止反应，进行SDS-PAGE电泳。结果表明，反应15分钟时修饰率较低，大部分白介素-2没有被修饰，反应30分钟时修饰率有所提高，产物以修饰一条的白介素-2为主，反应1小时，高修饰条带增加，反应2小时与反应1小时相比，高修饰条带略有增加。反应pH值的选择取5支1.5ml Eppendorf管，每管加入白介素-2浓缩液0.5ml(2.0mg/ml)，再加入等体积0.05M的硼砂缓冲液，pH值分别为6.0、7.0、7.5、8.0、9.0，每支试管分别加入6.0mg的SC-PEG，反应30分钟后终止反应，进行SDS-PAGE电泳。结果表明当pH为6.0时修饰率过低，大部分白介素-2没有被修饰，而pH为9.0时修饰过度，高修饰产物较多，且不均一，不利于保持活性。实施例3修饰产物的分离纯化与鉴定取2支1.5ml Eppendorf管，每管加入白介素-2浓缩液0.5ml(2.0mg/ml)，再加入等体积0.05M的pH为7.5的硼砂缓冲液，再加入SC-mPEG固体6.0mg，混匀，于4℃反应30min，终止反应。取上述反应液分别上柱分离。色谱条件Sephacryl S-200(1cm×50cm)，流动相为50mM醋酸缓冲液(pH6.0)，流速0.3ml/min。收集各洗脱峰。结果表明，分子量大于标准白介素-2的洗脱峰有两个，分别为单一修饰的白介素-2和多修饰的白介素-2。将各洗脱峰适当浓缩，采用SDS-PAGE电泳检测，分离胶15％，浓缩胶5％。结果见图1，各分离组分呈单一条带，表明修饰条带与未修饰条带被完全分离开。图中，Mmarker。1分离前的PEG-IL-2反应液。2，3分离到的PEG-IL-2，其中2为多修饰的PEG-IL-2，3为单修饰的PEG-IL-2。实施例4分离后各组分的抗病毒活性测定参照中国生物制品规程(2000年版)中的方法，对分离到的单一修饰产物、多修饰产物和未修饰组分的活性(以IU/mg表示)进行测定，并以白介素-2原液的活性为对照，计算活性的保留情况。结果表明单一修饰产物的活性保留率达60％以上，多修饰产物的活性保留率达30％以上，而未修饰组分的活性保本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种聚乙二醇修饰重组人白介素，其特征在于，重组人白介素上连接有一条、两条或者两条以上的聚乙二醇链。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：魏东芝，宫兴文，何明磊，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]