本发明专利技术涉及一种兔白介素1beta(IL-1β)重组蛋白的制备方法，属于分子生物领域。本发明专利技术的制备兔白介素1β的方法，包括以下步骤：1)引物设计：引物序列如SEQ ID NO：2-3所示；2)PCR扩增，获得扩增产物；3)重组质粒的构建；4)蛋白的诱导表达；5)蛋白纯化及蛋白复性。本发明专利技术通过基因重组、重组蛋白表达纯化和复性技术获得可溶性兔白介素1β重组蛋白；用重组蛋白免疫母鸡后产生高效价的抗体：血清抗体效价为1：64000，卵黄抗体效价为11.5ng/ml，可见本发明专利技术获得的重组蛋白具有理想生物学活性，在国内属首创。
【技术实现步骤摘要】
兔白介素1β重组蛋白的制备方法
本专利技术涉及一种白介素重组蛋白，尤其涉及一种兔白介素1β重组蛋白，属于分 子生物领域。
技术介绍
白细胞介素-I(IL-I)，是一种主要由单核细胞、巨噬细胞合成分泌的蛋白质多肽。 人的IL-I相对分子量为15KDa?17KDa，根据其分子结构和等电点的差异，可将其分为两个 分子亚型（IL-1alpha、IL-Ibeta)，这两个亚型之间氨基酸序列有很大差别，但他们可识 别同一个受体IL-1R。 IL-I具有广泛的免疫调节作用：促进胸腺细胞、T细胞的活化增殖和分化；诱导单 核细胞和巨噬细胞产生IL-6和TNFalpha;协同IL-4等细胞因子刺激B细胞的增殖和分 化；通过提高NK细胞对IL-2等细胞因子的敏感性增强其杀伤活性；促进IL-2、IL-3、IL-4 等多种免疫分子基因的表达。白介素1β还具有影响消化吸收等功能。 目前国内对动物细胞因子的研究较少，兔白介素1β尚无人研究，缺乏重组蛋白 产品。兔子是常用的实验动物之一，具有重要的医学价值；由于其重要的临床医学价值，白 介素Ιβ已成为研究热点之一。重组蛋白经常以包涵体形式表达，不能以可溶性蛋白形式 存在，从而降低了其应用价值，而复性技术是亟待解决的技术难题。
技术实现思路
本专利根据已发表的兔白介素Ibeta(li3)基因序列，设计针对兔白介素1β基 因的特异引物，通过PCR扩增和基因重组技术，经原核系统表达获得了兔白介素1β重组蛋 白，采用亲和吸附柱纯化技术获得了生物纯兔白介素1β重组蛋白，由于该重组蛋白以包 涵体形式表达，本专利技术专利技术出蛋白复性技术将包涵体还原为可溶性蛋白。该兔白介素1β 重组蛋白可以用于相关研究也可作为标准品用于ELISA等酶联免疫分析和疾病诊断，也可 应用于抗体的制备。 本专利技术首先公开了一种制备兔白介素1β重组蛋白的方法，包括以下步骤： 1)引物设计：设计并合成扩增兔白介素1β的引物，引物序列如SEQIDNO:2_3 所示； 2)PCR扩增：以含有SEQIDNO:1所示基因序列的DNA为模板进行扩增，PCR扩 增程序为：95°C预变性15min;94°C45s，58°C45s，72°C60s，共30个循环；最后72°C延续 lOmin，获得扩增产物； 3)重组质粒的构建：采用内切酶酶切前述扩增产物后连接到同一内切酶酶切的 原核表达载体pET32a质粒上，连接产物转化感受态细胞DH5α，筛选重组质粒并测序； 4)蛋白的诱导表达：测序正确的重组质粒命名为pET32a-rabbitIL-Iβ，转化感 受态细胞BL21，IPTG诱导重组蛋白表达； 5)蛋白纯化：菌体裂解后收集包涵体，镍柱纯化后经蛋白复性，获得纯化的兔白 介素1β重组蛋白。 优选的，步骤5)所述蛋白纯化具体包括以下步骤： Α.包涵体处理：采用裂解液裂解菌体后离心弃上清，采用BufferBl溶解沉淀并 离心，上清含有兔白介素1β包涵体蛋白用于下一步的分离纯化； Β.分离纯化：分离纯化采用镍柱亲和层析，层析介质为Ni-NTA，以20ml灭菌水清 洗Ni-NTA预装柱，然后用IOmlBufferB2平衡Ni-NTA预装柱后上样；再用IOmlBuffer B2和20mlWashBuffer清洗Ni-NTA预装柱；最后用IOmlBufferE洗脱Ni-NTA预装柱， 收集洗脱液，获得纯化的兔白介素1β包涵体蛋白； C.蛋白复性：将兔白介素1β包涵体蛋白稀释到浓度在0.Iyg/μ 1以下，经TGE 缓冲液透析，浓缩，收集获得复性后的兔白介素1β蛋白。 更优的，步骤A所述裂解液的配方为：50mMNaH2P04、300mMNaCUlOmM咪唑、0. 5mM PMSF，pH8.0;所述BufferBI的配方为：100mMNaH2P04、10mMTris、6M盐酸胍，ρΗ8·0。 更优的，步骤B所述BufferΒ2 的配方为：100mMNaH2P04、10mMTris、8M尿素， ρΗ8· 0 ;所述WashBuffer的配方为：IOOmMNaH2PO4UOmMTris、20mM咪唑、8M尿素，ρΗ8· 0 ; 所述BufferE的配方为：100mMNaH2P04、10mMTris、250mM咪唑、8Μ尿素，ρΗ8· 0。 更优的，步骤C所述TGE缓冲液的配方为：50mMTris-HCl、50mMNaCl、0. 5mM EDTA、5%甘油、1%甘氨酸、ΙΟπιΜβ-巯基乙醇、0· 5mMPMSF，pH8. 0。 对重组蛋白免疫原性进行测定，用重组蛋白免疫母鸡后产生高效价的抗体（血清 抗体效价为1 =64000,卵黄抗体效价为11. 5ng/ml)，表明所获得的重组蛋白具有理想生物 学活性。 本专利技术第二方面公开了一种用于扩增兔白介素1β的引物序列，包括上游引物Fl 和下游引物F2,上游引物Fl的序列如SEQIDNO:2所示，下游引物F2的序列如SEQIDNO: 3所示。 进一步的，前述引物扩增的模板为含有SEQIDNO:1所示基因序列的DNA。 更进一步的，前述引物扩增的模板为pUC57_rabbitIL-Iβ质粒。 本专利技术第三方面公开了前述制备兔白介素1β的方法以及用于扩增兔白介素1β 的引物对在兔白介素1β重组蛋白生产中的应用。 本专利技术公开了制备兔白介素1β的方法以及纯化复性技术，制备的高纯度产品可 用于ELISA酶联免疫分析，疾病诊断，或白介素1β抗体制备等领域。 本专利技术的有益效果是：本专利通过基因重组、重组蛋白表达纯化和复性技术获得 可溶性高纯度的兔白介素1β重组蛋白，所获得的重组蛋白具有理想的免疫原性（生物活 性），在国内属首创。 【附图说明】 图1为兔白介素1β基因PCR扩增结果，其中M为Marker，1为PCR扩增出的兔白 介素1β基因； 图2为PCR扩增兔白介素1β基因双酶切和原核表达载体pET32a双酶切结果。其 中M为Marker，1为pET32a双酶切后条带，大小为5. 9kb;2为PCR扩增兔白介素1β基因 双酶切条带基因大小为807bp; 图3为兔白介素1 β原核表达载体的克隆筛选及鉴定结果； 图4为编号①的阳性克隆测序结果和NCBI公布的目的基因序列比对； 图5为兔白介素1 β蛋白表达和检测结果，其中1为阴性对照，2为诱导表达后的 裂解液上清，3为诱导表达后的裂解液沉淀（包涵体）； 图6为兔白介素1β蛋白镍柱纯化结果，其中1为Marker, 2-15分别代表纯化收 集的1-14管兔白介素1β重组蛋白； 图7为兔白介素1β蛋白的复性结果，其中1为包涵体兔白介素1β蛋白经透析 复性后的结果； 图8为兔白介素1β蛋白活性检测结果；其中，A为鸡血清中抗体效价（血清稀释 64000倍），B为卵黄抗体效价；血清和卵黄均显示随着免疫次数增加，抗体滴度增加。 【具体实施方式】 以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并 非用于限定本专利技术的范围。 实施例1重组质粒的构建 LPCR扩增 根据已知的兔白介素1β基因序列（SEQIDNO: 1所示）设计PCR上游本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备兔白介素1β重组蛋白的方法，包括以下步骤：1)引物设计：设计并合成扩增兔白介素1β的引物，引物序列如SEQ ID NO：2‑3所示；2)PCR扩增：以含有SEQ ID NO：1所示基因序列的DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增程序为：95℃预变性15min；94℃45s，58℃45s，72℃60s，共30个循环；最后72℃延续10min，获得扩增产物；3)重组质粒的构建：采用内切酶酶切前述扩增产物后连接到同一内切酶酶切的原核表达载体pET32a质粒上，连接产物转化感受态细胞DH5α，筛选重组质粒并测序；4)蛋白的诱导表达：测序正确的重组质粒命名为pET32a‑rabbit IL‑1β，转化感受态细胞BL21，IPTG诱导重组蛋白表达；5)蛋白纯化：菌体裂解后收集包涵体，镍柱纯化后经蛋白复性，获得纯化的兔白介素1β重组蛋白。
【技术特征摘要】
1. 一种制备兔白介素10重组蛋白的方法，包括以下步骤： 1) 引物设计：设计并合成扩增兔白介素10的引物，引物序列如SEQ ID NO :2-3所示； 2. PCR扩增：以含有SEQ ID NO : 1所示基因序列的DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩 增程序为：95°C预变性15min ;94°C 45s，58°C 45s，72°C 60s，共30个循环；最后72°C延续 lOmin，获得扩增产物； 3) 重组质粒的构建：采用内切酶酶切前述扩增产物后连接到同一内切酶酶切的原核 表达载体pET32a质粒上，连接产物转化感受态细胞DH5 a，筛选重组质粒并测序； 4) 蛋白的诱导表达：测序正确的重组质粒命名为pET32a-rabbit IL-1 0，转化感受态 细胞BL21，IPTG诱导重组蛋白表达； 5) 蛋白纯化：菌体裂解后收集包涵体，镍柱纯化后经蛋白复性，获得纯化的兔白介素 重组蛋白。2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5)所述蛋白纯化具体包括以下步 骤： A. 包涵体处理：采用裂解液裂解菌体后离心弃上清，采用Buffer B1溶解沉淀并离心， 上清含有兔白介素10包涵体蛋白用于下一步的分离纯化； B. 分离纯化：分离纯化采用镍柱亲和层析，层析介质为Ni-NTA，以20ml灭菌水清洗 Ni-NTA预装柱，然后用10ml Buffer B2平衡Ni-NTA预装柱后上样；再用10ml Buffer B2 和20ml Wash Buffer清洗Ni-NTA预装柱；最后用10ml Buffer E洗脱Ni-NTA预装柱，收 集洗脱液，获得纯化的兔白介素10包涵体蛋白； C. 蛋白复性：将兔白介素10包涵体蛋白稀释到浓度在0. ly g/yl以下，经TGE缓...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈金文，李文静，张文文，陈凌燕，路雅丽，姜自彬，
申请(专利权)人：烟台基诺莱斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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