公开了一种使含有重组DNA的反式-4-羟脯氨酸生物合成系统活性增强的方法。其中，含有重组DNA的反式-4-羟脯氨酸生物合成系统是在2-酮戊二酸和亚铁离子存在下，作用于游离的L-脯氨酸并生成反式-4-羟脯氨酸的具有脯氨酸4-羟化酶活性的重组微生物。同时，本发明专利技术还提供反式-4-羟脯氨酸的生物合成方法。
【技术实现步骤摘要】
一种使含有重组DNA的反式-4-羟脯氨酸生物合成系统活 性增强的方法
一种使含有重组DNA的反式-4-羟脯氨酸生物合成系统活性增强的方法，属于微 生物基因工程领域。
技术介绍
羟脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp)为亚氨基酸，是脯氨酸羟基化后的产物，根据 其羟基化位置的不同，可分为3-羟脯氨酸（3-Hyp)或4-羟脯氨酸（4-Hyp)。自然界中反 式-4-羟脯氨酸较为常见，反式-4-羟脯氨酸是动物组织蛋白如胶原等的重要组成部分。反 式-4-羟脯氨酸广泛应用于医药、化工、动物饲料、营养和美容业等方面。 目前，生产反式-4-羟脯氨酸的方法有化学合成法、生物提取法以及微生物酶法。 化学合成方法合成步骤较多，成本高，不适合工业生产。而生物提取法利用动物蛋白来源如 明胶、猪皮为原料，经酸、碱或蛋白水解酶水解后提取反式-4-羟脯氨酸，该法纯化步骤长， 成本高，浪费大量原料，且废弃物污染严重，很容易被市场淘汰。随着DNA重组技术的发展 以及微生物资源的发现，使得微生物酶法生产反式-4-羟脯氨酸成为工业上很有前景的生 产方法。 脯氨酸4-羟化酶在宿主菌中，需以大量的氧气为底物，将L-脯氨酸催化生成反 式-4-羟脯氨酸，很容易导致宿主菌在发酵过程中氧气的不足，而透明颤菌血红蛋白可以 在低氧条件下结合环境中的氧气，起到富集氧气以供宿主细胞利用的作用，从而提高宿主 细胞的氧气利用率。因此，为了解决低溶氧对反式-4-羟脯氨酸生产的限制，在分子水平上 引入透明颤菌血红蛋白基因，会有效地促进宿主菌的生长和脯氨酸4-羟化酶的催化，最终 提高反式-4-羟脯氨酸的生产效率。
技术实现思路
针对目前生物提取法获得反式-4-羟脯氨酸成本高、污染大、提取率低的缺陷，以 及微生物发酵法生产反式-4-羟脯氨酸时需氧量大、溶氧不足会限制反式-4-羟脯氨酸合 成的缺点，本专利技术要解决的问题是提供一种使含有重组DNA的反式-4-羟脯氨酸生物合成 系统活性增强的方法。 本专利技术为了高效利用脯氨酸4-羟化酶生产反式-4-羟脯氨酸，提供了一种使重组 微生物中的经密码子优化后的反式-4-羟脯氨酸合成基因的拷贝数增加以及向重组微生 物中导入透明颤菌血红蛋白基因的方法，利用该方法可高效生产反式-4-羟脯氨酸。 本专利技术是一种使含有重组DNA的反式-4-羟脯氨酸生物合成系统活性增强的方 法。其特征是：含有重组DNA的反式-4-羟脯氨酸生物合成系统是通过将具有脯氨酸4-羟 化酶活性的蛋白质的基因片段和透明颤菌血红蛋白基因片段重组到载体上并转入微生物 细胞中，得到的具有反式-4-羟脯氨酸生物合成活性的重组微生物，并提供了反式-4-羟脯 氨酸的生产方法。 上述的脯氨酸4-羟化酶是在2-酮戊二酸和亚铁离子存在的情况下，可使游离的 L-脯氨酸转化为反式-4-羟脯氨酸的酶。 上述的重组微生物除了大肠杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属等属的 微生物菌株外，还可以使用酵母菌等。 上述的重组微生物以大肠杆菌等作为宿主菌时，脯氨酸4-羟化酶和透明颤菌 血红蛋白表达载体在微生物中独立复制的同时，最好由启动子、核糖体结合序列、脯氨酸 4_羟化酶基因、透明颤菌血红蛋白基因、转录终止序列组成。 上述的重组微生物以大肠杆菌为宿主菌时，表达载体包括但不局限于pET28a、 pKYPIO等质粒。 上述的表达载体中启动子可采用Iac启动子、PL启动子、trp启动子、trp串联启 动子或者17启动子等。 上述的表达载体中核糖体结合序列，只要在大肠杆菌等宿主中能表达即可，核糖 体结合位点和起始密码子之间保留适当的距离。 上述的重组微生物以大肠杆菌为宿主时，可使用大肠杆菌JM109、大肠杆菌 DH5 α、大肠杆菌BL21 (DE3)、大肠杆菌SCS110、大肠杆菌W3310等。 上述的的反式-4-羟脯氨酸生物合成系统活性增强的方法是通过使重组微生物 中的经密码子优化后的脯氨酸4-羟化酶基因的拷贝数增加以及向重组微生物中导入透明 颤菌血红蛋白基因来实现。 上述的使宿主菌中的脯氨酸4-羟化酶基因的拷贝数增加是通过将经密码子优化 后的脯氨酸4-羟化酶基因重组到多拷贝质粒上来实现的。 上述的脯氨酸4-轻化酶基因来源于指胞囊菌RHl (Dactylosprangium sp. RH1), 上述的透明颤菌血红蛋白基因来源于透明颤菌（Vitreoscilla sp.)。 上述的反式-4-羟脯氨酸的生产方法，以大肠杆菌、棒状杆菌、酵母菌等微生物作 为重组微生物进行培养时，培养基只要含有微生物可以利用的碳源、氮源、无机盐、金属离 子，都可有效培养重组微生物，无论培养基是合成培养基还是天然培养基。 上述的反式-4-羟脯氨酸的生产方法中，作为碳源只要是微生物能够利用的均 可，可使用葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、半乳糖以及醋酸、乙醇等。 上述的反式-4-羟脯氨酸的生产方法中，作为氮源可以是氨水、硫酸铵、氯化铵、 磷酸铵等各种无机铵盐，还可以是其他含氮有机物，如肉汁提取物、酵母抽提物、玉米浆、胰 蛋白胨、豆柏、豆饼、各种发酵菌体以及其消化物等。 上述的反式-4-羟脯氨酸的生产方法中，作为无机盐可使用氯化钠、磷酸氢二钾、 磷酸二氢钾、氯化钙等。 上述的反式-4-羟脯氨酸的生产方法中，作为金属离子可使用硫酸亚铁、硫酸镁 等。 上述的反式-4-羟脯氨酸的生产方法中，在培养时重组微生物采用诱导型启动子 的表达质粒时，根据需要在培养基中补加诱导物。如果使Iac启动子或者T7启动子的表达 质粒，在培养基中补加乳糖或者IPTG (异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）等，而使用trp 启动子的表达质粒时，需在培养基中补加吲哚丙烯酸（IAA)。 上述的反式-4-羟脯氨酸的生产方法，重组微生物可利用培养基中的碳源产生 2-酮戊二酸并在培养基中积累2-酮戊二酸。 本专利技术所提供的使含有重组DNA的反式-4-羟脯氨酸生物合成系统活性增强的方 法，具有重要的工业应用价值。 【附图说明】 图1.反式-4-羟脯氨酸在大肠杆菌细胞中的生物转化途径。 图2.色氨酸启动子质粒图谱。 图 3.表达质粒 pUC19-ptrp2_Hyp 图谱。 图 4.表达质粒 pUC19-ptrp2_Hyp-VHb 图谱。 【具体实施方式】 LB 培养基：1 % (W/V)胰蛋白胨，0· 5 % (W/V)酵母抽提物，1 % (W/V)NaCl， pH7. 0-7. 2。 Amp 抗性平板：1% (W/V)胰蛋白胨，0. 5% (W/V)酵母抽提物，1% (W/V)NaCl， I. 5% (W/V)琼脂糖，氨苄青霉素50 μ g/mL。 SOC培养基（用于感受态细胞的复苏）：2% (W/V)胰蛋白胨，0· 5% (W/V)酵母抽 提物，0.05% (W/V)NaCl，2.5mM KC1，IOmM MgCl2, 20mM 葡萄糖。 5XKCM(大肠杆菌转化缓冲液）：0· 5M KC1，0. I5M CaCl2,0· 25M MgCl2。 反式-4-羟脯氨酸的定量测定：将发酵液离心后，取上清，稀释后取2. 5本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种使含有重组DNA的反式‑4‑羟脯氨酸生物合成系统活性增强的方法，其中，含有重组DNA的反式‑4‑羟脯氨酸生物合成系统是通过将具有脯氨酸4‑羟化酶活性的蛋白质的基因片段重组到载体上并转入微生物细胞，得到的具有反式‑4‑羟脯氨酸生物合成活性的重组微生物，本专利技术还提供反式‑4‑羟脯氨酸的生产方法。
【技术特征摘要】
1. 一种使含有重组DNA的反式-4-羟脯氨酸生物合成系统活性增强的方法，其中，含有 重组DNA的反式-4-羟脯氨酸生物合成系统是通过将具有脯氨酸4-羟化酶活性的蛋白质 的基因片段重组到载体上并转入微生物细胞，得到的具有反式-4-羟脯氨酸生物合成活性 的重组微生物，本发明还提供反式-4-羟脯氨酸的生产方法。2. 权利要求1所述的使反式-4-羟脯氨酸生物合成系统活性增强的方法，其特征在于 通过优化脯氨酸4-羟化酶基因的密码子，并使重组微生物中的经密码子优化后的脯氨酸 4_羟化酶基因的拷贝数增加以及向重组微生物中导入透明颤菌血红蛋白基因来实现。3. 权利要求2所述的重组微生物中的脯氨酸4-羟化酶基因的拷贝数增加是通过将经 密码子优化后的脯氨酸4-羟化酶基因连接到多拷贝质粒中来实现的。4. 权利要求2所述的透明颤菌血红蛋白基因来源于透明颤菌（Vi...
【专利技术属性】
技术研发人员：张震宇，刘合栋，张胜利，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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