利用转谷氨酰胺酶形成新的促红细胞生成素缀合物制造技术

本发明专利技术提供了具有生物活性的促红细胞生成素（ＥＰＯ）缀合物的组合物，其中采用转谷氨酰胺酶反应来共价地并位点特异性地缀合ＥＰＯ分子到一种非抗原性的亲水聚合物上，其也可以共价连接到一种有机分子上，这两种修饰都增加了组合物的循环血清半衰期。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用酶学方法制备的新的促红细胞生成素制剂，该方法通过一级序列的突变将基团连接到其结构上或者改变其生物活性。特别地，本专利技术涉及具有改变的生理化学和药物动力学性质的促红细胞生成素缀合物的化合物。
技术介绍
促红细胞生成素(EPO)是一种天然形成的醣蛋白，其功能是作为集落刺激因子并作为主要因子参与红细胞合成的调节。促红细胞生成素通过刺激骨髓中的前体细胞、促使它们分裂并分化成为成熟红细胞而起作用。这个过程在体内是严格控制的，这样红细胞在循环中的破坏或清除才能与新细胞的形成速度匹配。天然存在的EPO是在肾脏中产生的一种糖蛋白(Jacobs等人，Nature 313(6005)，806-810(1985)。已经利用重组DNA技术来生产促红细胞生成素，其通过克隆EPO基因并在中国仓鼠卵巢细胞中表达(Lin，US 5618698)。重组生产的EPO已经作为一种治疗各种形式贫血症的有效治疗试剂供应一段时间，所述贫血症包括与慢性肾衰竭、叠氮胸苷治疗的HIV感染患者以及骨髓抑制性化疗的癌症患者相关的贫血症。该糖蛋白经非胃肠给药，其在含有人血清白蛋白(HSA)为载体的常规缓冲水溶液中作为静脉(IV)或者皮下(SC)注射剂。这种制剂以EPOGEN和PROCRIT为商品名在美国市场上销售。这些产品含促红细胞生成素，呈1毫升不含防腐剂的单次给药规格或者2ml的含防腐剂的多次给药规格的小瓶。在这些制剂被证明非常成功的同时，某些缺陷也与之关联起来。目前，诸如促红细胞生成素的蛋白质治疗剂的生物活性周期受到血浆的短半衰期和对蛋白酶降解易感性的限制。诸如EPO这样的治疗性蛋白质的短半衰期只有4小时，为了最大的临床功效，频繁给药成为必要。这对慢性状况的治疗是不利的，并可能导致不好的病人的依从性，因此达不到最佳效果。因而进行了很大努力来增加EPO的血浆半衰期。近年来，诸如聚乙二醇(PEG)的非抗原性水溶性聚合物被运用于对治疗和诊断有重大意义的多肽的共价修饰上。例如，PEG共价连接到诸如白介素(Knauf，M.J.等人，J.Biol.Chem.1988，263，15，064；Tsutsumi，Y.等人，J.Controlled Release 1995，33，447)、干扰素(Kita，Y.等人，Drug Des Delivery 1990，6，157)、过氧化氢酶(Abuchowski，A.等人，J.Biol Chem.1977，252，3，582)、超氧化物岐化酶(Beauchamp，C.O.等人，Anal Biochem.1983，131，25)以及腺苷脱氨酶(Chen，R.等人，Biochim，Biophys.Acta.1981，660，293)的治疗性多肽上，已经报道了延长它们的体内半衰期、和/或降低它们的免疫原性和抗原性。衍生的PEG化合物以前就已公开(US5438040，1995年8月1日，缀合物-稳定的多肽组合物、包含它的治疗性送递和诊断制剂以及制造和使用它的方法，N.N.Ekwuribe)。这种翻译后衍生的方法同样适用于EPO。例如，WO94/28024公开了一种具有促红细胞生成素活性的糖修饰的聚合物缀合物，其中PEG通过被氧化的糖连接。US4904584公开了删除赖氨酸的多肽变体的聚环氧烷缀合物，包括EPO。WO 90/12874描述了单甲氧基-PEG-EPO(mPEG-EPO)的制备，其中EPO包含了一个半胱氨酸残基，由基因工程导入，特定PEG试剂被共价连接到它上面。其它PEG-EPO组合物在EP 605693、US6,077,939、WO01/02017和EP 539167中公开。许多用纯化学方法通过缀合到PEG上(“PEG化”)修饰蛋白质的方法都经常有一个受限制的方面，那就是没有可选择性并且经常会与存在于可接近的赖氨酸残基上和/或蛋白质的N端胺上的氨基不完全反应。其它的化学方法要求糖基的氧化作为修饰策略的一部分，这同样会导致不完全或不连续反应以及不明确的产物组合物。这样，考虑目前所拥有的选择，一种在温和的、位点特异性方式下修饰EPO的方法是更有利的。转谷氨酰胺酶(TGases)是催化钙依赖的酰基附加到伯胺上的蛋白质家族，其中肽结合的谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基团是酰基供体而伯氨基是酰基受体和胺供体。实际上，转谷氨酰胺酶通过催化相对蛋白质上的赖氨酸和谷氨酰胺残基的酰胺键的形成而交联蛋白质。一个公知的例子就是纤维蛋白通过转谷氨酰胺酶因子XIIIa交联。这种键是稳定的并对蛋白酶有抗性，因此转谷氨酰胺酶通常被用来连接细胞的结构组分。除了以上所述的血浆形式外，转谷氨酰胺酶还在诸如肝脏、皮肤和细胞外液等组织中被发现(Greenberg，C.S等人.FASEB J.1991，5，3071-3077)。转谷氨酰胺酶的原核生物形式也是公知的(Ando，H.等人.Agric.Biol.Chem 53(10)，2613-2617，1989；Washizu，K.等人.Biosci.Biotech.Biochem 58(1)，82-87，1994)。转谷氨酰胺酶的特征是非常显著的，每个蛋白质作为胺受体的残基通常只有一个，或者有些情况下有两个谷氨酰胺残基。来自不同的哺乳动物组织和物种的转谷氨酰胺酶已被广泛研究(Folk，J.E.和Chung，S.I.Adv.Enzym Molec.Biol.1973，38，109-191；Folk，J.E.和Finlayson，J.S.Adv.Protein Chem.1977，31，1-133；Folk，J.E和Cole，P.W.Biochim Biophys.Acta 1966，122，244-264；Folk，J.E.；Chung，S.I.Methods in Enzymology 1985，113，358-375；)。因此，转谷氨酰胺酶可以并且已经被用来在某些蛋白质上进行位点特异性的修饰谷氨酰胺残基(US6010871；US6331422；US6322996)。 蛋白质 蛋白质尽管有许多研究，但是关于转谷氨酰胺酶专一性的决定子的细节还很少被阐明。转谷氨酰胺酶在底物专一性上不同，但通常还没有鉴定出对于各个酶，作为含有或者接近底物残基的特定的序列基序的优先性(Gorman，J.J.；Folk，J.E.J.Biol.Chem.1981，256，2712-2715；Gorman，J.J.；Folk，J.E.J.Biol.Chem.1980，255，419-427)。唯一确定的规则是谷氨酰胺残基必须与N端距离至少3个残基来作为任意转谷氨酰胺酶的底物。通常，谷氨酰胺重复都显示出可以加强在这个重复中的谷氨酰胺残基的受体性质，谷氨酰胺残基的易接近性也显示出在决定它们作为转谷氨酰胺酶底物的能力方面非常重要(Kahlem，P.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，93，14580-14585)。尽管转谷氨酰胺酶修饰的位点特异性性质从20世纪60年代就被人们所知，在食物稳定方面的工业用途也进行了实践，但它在治疗性蛋白质修饰方面的用途最近才开始被探索。利用转谷氨酰胺酶将5000道尔顿或更大的含有脂肪族氨基的聚合物连接到蛋白质连接的谷氨酰胺残基在最近被Sato等在US 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有促使骨髓细胞增加红细胞产量的生物学性质的促红细胞生成素缀合物及其药学上可接受的盐或酯，包括具有下式的部分：ＥＰＯ－［Ｇｌｎ－Ａ－Ｘ－（Ｍ）↓［ｎ］］↓［ｙ］　其中ＥＰＯ是具有促使骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产量的生物学性质的促红细胞生成素或其药学上可接受的衍生物；Ｇｌｎ是选自ＥＰＯ一级序列中一个或多个谷氨酰胺残基的谷氨酰胺残基；ｙ是表示经修饰的谷氨酰胺残基数目的１到７的整数；Ａ是胺供体部分或羟基，Ｘ是任选的亲水聚合物部分；Ｍ是一种任选的有机分子，其特征在于它能够增加ＥＰＯ分子的循环半衰期；以及ｎ是０到１５的整数。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：CT普尔，
申请(专利权)人：森托科尔公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]