本发明专利技术公开了一种采用生物酶解法制备含有血管紧张素转移酶抑制活性肽的水解物方法及得到的三种具有高ＡＣＥ抑制活性的新型肽。本发明专利技术含有血管紧张素转移酶抑制活性肽的水解物以富含脯氨酸的牛皮为原料，用生物酶复合水解得到ＡＣＥ抑制活性ＩＣ↓［５０］＝０．１６８ｍｇ／ｍｌ的产品；经过超滤后ＩＣ↓［５０］＝０．０７９ｍｇ／ｍｌ；通过分析检测手段确定了该酶解物中含有具有高ＡＣＥ抑制活性的肽ＩＳＶＰＧＰＭ、ＬＧＰＶＧＮＰＧＰＡ、ＤＬＳＦＬＰＱＰＰＱＱ，该三种肽段为新的具有高的ＡＣＥ抑制活性的肽段，因此具有潜在的降血压功能。本发明专利技术得到的牛皮的生物酶复合酶解产物，是一种肽类水解物，对血管紧张素转移酶（ＡＣＥ）具有抑制作用，可广泛用于保健食品、功能性食品、辅助降压药物等产品，具有广泛的市场应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种具有血管紧张素转移酶抑制活性肽的制备方法，特别涉及到一种生物复合酶解方法，及采用该方法制备得到的三种新的ACE抑制活性肽， 具有降血压功能。
技术介绍
高血压病是一种全球性常见多发病。由于药物治疗高血压病会引起种种不 良的反应，因而从天然蛋白质中提取的食用安全性高，无副作用的降血压肽日 益成为非药物治疗高血压最有前景的产品。血管紧张素转换酶(简写为ACE， 二肽羟基肽酶，EC3, 4， 15， 1)，能够催 化血管紧张素I转化为血管紧张素II，从而导致血压升高。因此抑制ACE的活 性成为调控血压的一种手段。自1970年以来发现第一个自然产生的从毒蛇的毒液中分离得到的ACE抑 制物以来，不断有新的抗高血压活性肽被研究和发现。目前很多ACE抑制剂(卡 托普利等)已上市销售，尽管这类合成药物对降低高血压的作用是显著的，但 长期使用出现的不良反应表明仍需要无副作用的降血压治疗剂或非药物辅助 治疗制剂。目前已知许多食品蛋白来源的ACE抑制肽，来源包括鱼(欧洲专利 第1094071号)，动物奶蛋白(国际申请公开号W099/65326)及植物(中国专利公 开号CN1731934)，这些肽大多包含2-12个氨基酸残基。研究表明，在具有高 活性的ACE抑制肽的结构中，C端一般具有脯氨酸或疏水性氨基酸残基，因此 若蛋白原料中富含该类氨基酸，则有可能通过酶解得到高活性的ACE抑制肽。因此，本领域迫切需要提供一种具有较高ACE抑制活性的肽。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供新的多肽。本专利技术的另一个目的在于提供上述多肽的制备方法。本专利技术的第三个目的是提供上述多肽的用途。在本专利技术的第一方面，提供了一种分离或纯化多肽，它包括具有SEQ IDN0:1、 2或3所示氨基酸序列的多肽或其酶解产物多肽。在另一优选例中，所述的多肽具有SEQ IDN0:1、 2或3所示氨基酸序列。在本专利技术的第二方面，提供了一种如上述多肽的制备方法，所述的方法包 括步骤(a) 以前处理过的牛皮为原料，用胃蛋白酶及碱性蛋白酶进行复合酶解， 得到酶解液；(b) 将酶解液经过分级超滤进行分离，得到如上述的多肽。 在另一优选例中，将步骤(b)得到的多肽通过反相高效液相色谱制备及反相高效液相色谱/电喷雾离子阱质谱法及串联质谱(MS/MS)分析得到具有SEQ ID N0:1、 2或3所示氨基酸序列的肽段。在另一优选例中，鉴定得到三种肽的序列为ISVPGPM (SEQ ID N0:1)、 LGPVGNPGPA (SEQ ID NO:2) 、 DLSFLPQPPQQ (SEQ ID NO:3)。在另一优选例中，前处理后的牛皮用PHI-2的缓冲液浸泡溶胀不超过8小 时后机械间歇匀浆，加入生物酶酶解l-6小时。在另一优选例中，前处理后的牛皮质量与pH1-2的缓冲液体积的比例为lg: 5-10ml，机械匀浆2-4min后将浆液于IO(TC水浴中加热3-5min，冷却后加入 相同的缓冲液，使牛皮与缓冲液的质量体积比为lg: 15-20ml，然后机械匀浆 3-5min。在另一优选例中，所述缓冲液为氯化钾-盐酸缓冲液，离子强度为 0. 05-0. 1M。在另一优选例中，所述生物酶为胃蛋白酶及碱性蛋白酶的复合使用，终浓 度为0. 5% — 3. 0%;在另一优选例中，对所述的酶解液进行超滤，其中截留分子量孔径在 5000-10000MW之间。在另一优选例中，对超滤物采用反相高效液相法分离，色谱柱选用SF-C18 柱，采用两种溶剂体系进行洗脱，洗脱时乙腈的比例由5%梯度提升至60%。在另一优选例中，对HPLC制备分离中活性最高的组分进行质谱分析，通 过反相高效液相色谱制备及反相高效液相色谱/电喷雾离子阱质谱法及串联质谱(MS/MS)得到具有血管紧张素转移酶抑制活性的肽段组成。在本专利技术的第三方面，提供了一种组合物，它含有治疗有效量的如上述的 多肽和生物学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物，食品组合物，功能性食 品，或保健品。在本专利技术的第四方面，提供了一种如上述的多肽的用途，它可用于制备血 管紧张素转移酶抑制剂。在另一优选例中，所述的抑制剂可用于降低血压。在另一优选例中， 一种包括具有SEQ ID N0:1、 2或3所示氨基酸序列的 多肽的可用于制备降低血压的药物。在另一优选例中，所述的可降低血压的药物具有抑制血管紧张素转移酶的 作用。在另一优选例中，生物酶解后水解物IC5。=0. 168mg/ml;超滤分离后组分的 IC5。=0.079mg/ml;三种新的活性肽的ICs。分别为ISVPGPM(SEQ ID N0:1)的 IC5。=0.017mg/ml 、LGPVGNPGPA(SEQID N0:2) 的IC5。=0.077mg/ml 、 DLSFLPQPPQQ(SEQ ID N0:3)的IC5。〈0. 08mg/ml 。据此，本专利技术提供了具有较高ACE抑制活性的多肽。如本文所用，"生物学上可接受的载体"指用于治疗剂给药、用于制作食 品、用于辅助治疗的治疗剂给药、和/或用于制作保健品或功能性食品的载体， 包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些载体它们本身并不是必要的活 性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知 的。在组合物中生物学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。 另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如崩解剂、润湿剂、乳化剂、PH 缓冲物质等。来自于本专利技术提供的多肽之外的非必要成分，以及其他非必要成 分(例如其他辅助性成分)，也包括在生物学上可接受的载体的定义中。本专利技术提供一种具有血管紧张素转移酶抑制活性肽的制备方法，特别涉及 到一种生物复合酶解方法，及采用该方法制备得到的三种新的ACE抑制活性肽。 本专利技术的目的可以通过以下的步骤来实现1. 用pHl-2的缓冲液浸泡前处理(脱脂及去除非胶原蛋白)后的牛皮，质 量与pHl-2的缓冲液体积的比例为lg: 5-10ml，浸泡溶胀不超过8小时后机械 间歇匀浆，匀浆2-4min后将浆液于10(TC水浴中加热变性5-10min，冷却后加 入相同的缓冲液，使牛皮与缓冲液的质量体积比为lg: 15-20ml，然后再次机 械匀浆3-5min;2. 以上匀浆后溶液置于恒温水浴中，温度35-45。C，待匀浆液升温至恒温 时加入胃蛋白酶，酶料质量比为1: 10-100，酶解l-4小时，反应结束后加入 Tris使终浓度为0. 05M-1. 0M，加入NaOH溶液调节溶液pH至中性，调节温度 50-7(TC,待匀浆液升温至恒温时加入碱性蛋白酶，酶料质量比为1: 20-200， 酶解l-4小时，反应结束后于沸水浴中加热灭酶12min后，冷却至室温；3. 将酶解液离心后的上清液微滤后超滤，高活性组分进行减压蒸馏浓縮；4. 将浓縮后高活性组分经反相高效液相色谱制备分离，收集液冷冻干燥；5. 反相高效液相色谱分离得到高活性组分用反相高效液相色谱/电喷雾离 子阱质谱法及串联质谱分析纯度及性质。所述酶解液离心的时间为10-20min，离心转速为8000-10000rpm;所述超滤为截流分子量(MWCO)为5000-10000的超滤膜；所述浓縮后样品以100-200mg/ml的浓本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离或纯化多肽，其特征在于，它包括具有ＳＥＱＩＤＮＯ：１、２或３所示氨基酸序列的多肽或其酶解产物多肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：沈亚领，马志英，严维凌，沈菊泉，魏东芝，董莹，汤俊，谢志镭，任莉萍，鲍熹珺，刘伯雅，
申请(专利权)人：华东理工大学，上海市食品研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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