一种鱼精蛋白的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种鱼精蛋白的检测方法，利用氨基化氧化石墨烯加入到ANS‑PAA体系中时，ANS‑PAA的荧光发生猝灭，往该体系中加入鱼精蛋白后，由于鱼精蛋白带有很强的正电荷，它能够将带负电荷的ANS‑PAA荧光聚合物从氨基化GO表面夺取过来，从而使ANS‑PAA的荧光强度得到回升，且回升强度与所加的鱼精蛋白浓度成正比，据此建立了一种快速检测鱼精蛋白的方法。与现有技术相比，本发明专利技术提供的检测方法操作简单，检测限低，能快速准确地对鱼精蛋白进行检测。

Method for detecting protamine

The present invention provides a method for detecting protamine, the amino functionalized graphene oxide is added to the ANS PAA system, ANS PAA fluorescence quenching, adding protamine in the system, because the protamine leucorrhea has a strong positive charge, it can be from the amino GO capture surface come with ANS PAA fluorescent polymer negative charge, so that the fluorescence intensity of ANS PAA can be recovered, and the recovery of strength and concentration of protamine added is proportional to set up a method for rapid detection of protamine. Compared with the prior art, the detection method provided by the invention has the advantages of simple operation, low detection limit and rapid and accurate detection of protamine.

【技术实现步骤摘要】
一种鱼精蛋白的检测方法
本专利技术属于化学检测领域，具体涉及一种鱼精蛋白的检测方法。
技术介绍
最近20年，随着科技手段的进步以及人们在寻找天然食品防腐剂方面的积极努力，鱼精蛋白因其良好的抗菌活性和天然的活性受到广泛的关注。鱼精蛋白是从鱼类新鲜成熟精子中提取出来的一种多聚阳离子肽，具有高效，安全，功能性等特点，是值得开发的一种天然食品防腐剂。众所周知，鱼精蛋白具有很多医学方面的应用，比如：用于治疗因注射方面的肝素过量所引起的出血，是目前体外循环心脏手术唯一对抗肝素的药物。鱼精蛋白和DNA的复合体-核蛋白体在医学上被认为能提高肝功能，有效解除疲劳，具有强精作用，除此之外，鱼精蛋白还具有很高的营养性和功能性，能降血压、助呼吸、促消化等，这些也成为研究的热点。目前对鱼精蛋白的检测方法有很多，但是检测限和灵敏度达不到要求，而且，操作复杂。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种鱼精蛋白的检测方法，使用荧光回升传感法来检测鱼精蛋白，信号误差小，检测限低，选择性高，灵敏性高，操作简单。本专利技术提供的一种鱼精蛋白的检测方法，包括以下步骤：(1)制备GO–NH2；(2)制备ANS-PAA复合材料；(3)将GO–NH2溶液与ANS-PAA复合材料溶液混合后，得到GO–NH2/ANS-PAA体系，加入PBS缓冲溶液，然后用去离子水稀释后，调节pH至4.5-6.5，测量其荧光强度；(4)将GO–NH2溶液与ANS-PAA复合材料溶液混合后，分别加入不同浓度的鱼精蛋白溶液，加入PBS缓冲溶液，然后用去离子水稀释后，调节pH至4.5-6.5，搅拌混匀，静置，待稳定后，分别测量其荧光强度，构建荧光强度与鱼精蛋白溶液浓度的线性关系；(5)将GO–NH2溶液与ANS-PAA复合材料溶液混合后，加入未知浓度的鱼精蛋白溶液，加入PBS缓冲溶液，然后用去离子水稀释后，调节pH至4.5-6.5，搅拌混匀，静置，待稳定后，测量其荧光强度，通过步骤(4)的线性关系得到鱼精蛋白溶液浓度。进一步的，步骤(1)中制备GO–NH2方法为：A、在3.5-4℃以下，将浓硫酸、石墨粉和硝酸钠超声0.8-1h混匀后，加入高锰酸钾混合，关闭超声；在9-10℃下搅拌下反应2-2.3h；B、步骤A所得混合溶液再水浴加热至38-39℃超声下反应0.5-0.6h，再升温至96-98℃后加入去离子水终止反应；C、然后，再加入双氧水，反应后，再加入盐酸溶液；产物离心、洗涤，得到氧化石墨；D、然后，将氧化石墨分散在水中，超声振荡剥离后离心，上层清液即为氧化石墨烯分散液，烘干后得到氧化石墨烯；E、将合成的氧化石墨烯分散在PBS溶液中，加入EDC和NHS混合液，孵化后，加入乙二胺，再孵化后，所得混合溶液在3.5-4℃下保存10-14h，用PBS透析移去未反应的乙二胺，最后得到GO–NH2。进一步的，步骤(1)中制备GO–NH2方法具体为：A、量取23mL浓硫酸放入冰浴中冷却至3.5-4℃以下，称取1g石墨粉和0.5g硝酸钠与浓硫酸混合，开启超声，1-1.2h以后缓慢加入3g高锰酸钾，关闭超声；在9-10℃搅拌条件下，反应2-2.3h；B、步骤A所得混合溶液移置38-39℃水浴锅中，超声下反应0.5-0.6h，然后温度升高到96-98℃后加入60mL去离子水中止反应；C、随后加入25mL体积浓度为30％-35％的双氧水，反应15-16min后，再加入40mL体积浓度为10％-12％的盐酸溶液溶解，8000r/min速度下离心10min后，二次蒸馏水洗涤去除过量的酸及副产物，即得氧化石墨；D、将洗涤后呈中性的氧化石墨分散水中，超声振荡剥离40-41min，然后在2500r.min-1转速下离心30-35min，上层液即是氧化石墨烯分散液；在40-50℃下干燥2-3h；获得氧化石墨烯；E、将合成的20mg的氧化石墨烯分散在20mL的PBS缓冲溶液中，超声1h形成均匀分散液，然后加1mL的EDC和NHS的混合液在上述分散液中，30-31min孵化后，加入0.2mL乙二胺，2-2.5h孵化后，将混合液在3.5-4℃下保存10-14h，用PBS透析移去未反应的乙二胺，最后得到GO–NH2。步骤E中所述EDC和NHS的混合液的制备方法为：0.5gEDC和0.15gNHS溶解在20mL的二次蒸馏水中,备用。步骤(2)所述制备ANS-PAA复合材料的方法为：将PAA溶解在PBS缓冲溶液中，放在冰浴中静置，然后加入EDC和NHS，搅拌反应，然后加入ANS，冰浴下反应后，于室温下静置，然后离心除去未反应的ANS，加入无水乙醇，反应后，产物用无水乙醇洗涤后，即得ANS-PAA。进一步的，步骤(2)制备ANS-PAA复合材料的方法具体为：将1g纯净的PAA溶解在5mL的PH＝7.4的PBS缓冲溶液，将之放在冰浴中静置2h，然后加入20mgEDC和10mgNHS搅拌反应1h，再加入3.4gANS冰浴反应1h，然后室温静置22h，8000r/min下离心20min除去未反应的ANS，加入无水乙醇，3-10min后，用无水乙醇洗涤3-5次，即得ANS-PAA。步骤(2)中所述ANS是指4-氨基-1-萘磺酸钠四水合物；PAA是指聚丙烯酸。步骤(3)、步骤(4)和步骤(5)所得体系中ANS-PAA复合材料终浓度均为1mg.L-1，GO-NH2的终浓度均为65mgL-1。步骤(3)、步骤(4)和步骤(5)中优选的体系pH为5.2。步骤(4)中鱼精蛋白溶液终浓度为：0μgmL-1、0.5μgmL-1、1.4μgmL-1、1.8μgmL-1、2.5μgmL-1、3.8μgmL-1、4μgmL-1、4.5μgmL-1、6μgmL-1、10μgmL-1、15μgmL-1和20μgmL-1。步骤(4)中构建的荧光强度与鱼精蛋白溶液浓度的线性关系为：F＝83.1+34.97C；F为加入鱼精蛋白后的荧光强度，C是鱼精蛋白的浓度。本专利技术将乙二胺通过化学键修饰到氧化石墨烯(GO)表面生成氨基化氧化石墨烯(GO–NH2)，从而合成了氨基化氧化石墨烯复合材料，该材料包含大量的带正电荷的氨基基团。将4-氨基-1-萘磺酸钠四水合物(ANS)接枝到聚丙烯酸(PAA)上合成了一种带大量负电荷的荧光聚合物ANS-PAA。把氨基化氧化石墨烯加入到ANS-PAA体系中时，ANS-PAA的荧光发生猝灭。这是由于ANS-PAA和氨基化GO表面间存在非共价键作用(包括静电吸引和π–π作用)，ANS-PAA被吸附到氨基化GO表面从而使体系的荧光猝灭。当往该体系中加入鱼精蛋白后，由于鱼精蛋白带有很强的正电荷，它能够将带负电荷的ANS-PAA荧光聚合物从氨基化GO表面夺取过来，从而使ANS-PAA的荧光强度得到回升，且荧光强度与所加的鱼精蛋白浓度成正比，据此建立了一种快速检测鱼精蛋白的方法。与现有技术相比，本专利技术提供的检测方法操作简单，检测限低，能快速准确地对鱼精蛋白进行检测。附图说明图1A为GO的扫描电镜图；图1B为GO-NH2扫描电镜图；图2为石墨、GO和GO-NH2的XRD图谱；图3为石墨、GO、GO-NH2、ANS、PAA和ANS-PAA的FT-IR图谱；a-石墨，b-GO，c-GO-NH2，d-ANS，e-PAA，f-ANS-PAA；图4为检测体系本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鱼精蛋白的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:(1)制备GO–NH

【技术特征摘要】
1.一种鱼精蛋白的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:(1)制备GO–NH2；(2)制备ANS-PAA复合材料；(3)将GO–NH2溶液与ANS-PAA复合材料溶液混合后，得到GO–NH2/ANS-PAA体系，加入PBS缓冲溶液，然后用去离子水稀释后，调节pH至4.5-6.5，测量其荧光强度；(4)将GO–NH2溶液与ANS-PAA复合材料溶液混合后，分别加入不同浓度的鱼精蛋白溶液，加入PBS缓冲溶液，然后用去离子水稀释后，调节pH至4.5-6.5，搅拌混匀，静置，待稳定后，分别测量其荧光强度，构建荧光强度与鱼精蛋白溶液浓度的线性关系；(5)将GO–NH2溶液与ANS-PAA复合材料溶液混合后，加入未知浓度的鱼精蛋白溶液，加入PBS缓冲溶液，然后用去离子水稀释后，调节pH至4.5-6.5，搅拌混匀，静置，待稳定后，测量其荧光强度，通过步骤(4)的线性关系得到鱼精蛋白溶液浓度。2.根据权利要求1所述的鱼精蛋白的检测方法，其特征在于，步骤(1)中制备GO–NH2方法为：A、在3.5-4℃以下，将浓硫酸、石墨粉和硝酸钠超声0.8-1h混匀后，加入高锰酸钾混合，关闭超声；在9-10℃下搅拌下反应2-2.3h；B、步骤A所得混合溶液再水浴加热至38-39℃超声下反应0.5-0.6h，再升温至96-98℃后加入去离子水终止反应；C、然后，再加入双氧水，反应后，再加入盐酸溶液；产物离心、洗涤，得到氧化石墨；D、然后，将氧化石墨分散在水中，超声振荡剥离后离心，上层清液即为氧化石墨烯分散液，烘干后得到氧化石墨烯；E、将合成的氧化石墨烯分散在PBS溶液中，加入EDC和NHS混合液，孵化后，加入乙二胺，再孵化后，所得混合溶液在3.5-4℃下保存10-14h，用PBS透析移去未反应的乙二胺，最后得到GO–NH2。3.根据权利要求1或2所述的鱼精蛋白的检测方法，其特征在于，步骤(1)中制备GO–NH2方法具体为：A、量取23mL浓硫酸放入冰浴中冷却至3.5-4℃以下，称取1g石墨粉和0.5g硝酸钠与浓硫酸混合，开启超声，1-1.2h以后缓慢加入3g高锰酸钾，关闭超声；在9-10℃搅拌条件下，反应2-2.3h；B、步骤A所得混合溶液移置38-39℃水浴锅中，超声下反应0.5-0.6h，然后温度升高到96-98℃后加入60mL去离子水中止反应；C、随后加入25mL体积浓度为30％-35％的双氧水，反应15-16min后，再加入40mL体积浓度为10％-12％的盐酸溶液溶解，8000r/min速度下离心10min后，二次蒸馏水洗涤去除过量的酸及副产物，即得氧化石墨；D、将洗涤后呈中性的氧化石墨分散水中，超声振荡剥离40-41min，然后在...

【专利技术属性】
技术研发人员：许美姣，刘金水，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34