生物法制备16,17α‑环氧黄体酮的方法技术

本发明专利技术公开了生物法制备16,17α‑环氧黄体酮的方法，以简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94自身的胆固醇氧化酶对3‑羟基‑5烯‑16,17α‑环氧物进行生物发酵，实现16,17α‑环氧黄体酮的生物制造，替代传统化学工艺，提高16,17α‑环氧黄体酮转化率和收率。其中，底物为3‑羟基‑5‑烯‑16,17α‑环氧物，Arthrobacter simplex AS1.94为催化菌株，发酵后16,17α‑环氧黄体酮的收率大于90％，纯度大于98.5％。

Methods of biological preparation of 16,17 alpha epoxy progesterone

The invention discloses a method for biological preparation of 16,17 alpha epoxy progesterone, with simple Arthrobacter Arthrobacter simplex AS1.94 their cholesterol oxidase on 3 hydroxyl 5 ene 16,17 alpha epoxy biological fermentation, 16,17 alpha epoxy progesterone bio manufacturing, to replace the traditional chemical process, improve the 16,17 alpha epoxy progesterone conversion rate and yield. Among them, 3 hydroxy 5 substrate ene 16,17 alpha epoxy, Arthrobacter simplex AS1.94 catalytic strain, 16,17 alpha epoxy progesterone was more than 90% after fermentation, the purity is more than 98.5%.

【技术实现步骤摘要】
生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法
本专利技术涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体来说是利用微生物发酵3-羟基-5烯-16,17α-环氧物制备16,17α-环氧黄体酮的方法。
技术介绍
16,17α-环氧黄体酮作为中间体应用于几乎所有甾体激素包括地塞米松、倍他米松、6α-甲基氢化泼尼松、泼尼松、氢化泼尼松等产品的制造。甾体激素类药物是仅次于抗生素的一类重要药物，具有抗炎、抗免疫、避孕、抗癌、调节内分泌等多种作用,广泛应用于风湿、心血管病、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病、激素依赖性肿瘤等疾病的治疗。目前16,17α-环氧黄体酮的制备方法，国内外报道均采用传统的化学法制造，化学反应路线如下所示：环氧反应Oppenauer氧化以双烯孕酮醋酸酯为原料经双氧水氧化形成3-羟基-5烯-16,17α-环氧物，通过Oppenauer氧化使3-羟基-5烯转变成3-酮-4烯结构，再经水蒸汽蒸馏、萃取、浓缩、精制等最终获得16,17α-环氧黄体酮。该工艺水平的限制性因素在于Oppenauer氧化的有效反应较低，造成了反应过程副产物多，影响了转化率和收率，目前，投入100Kg双烯孕酮醋酸酯,仅能获取70～73Kg16,17α-环氧黄体酮，再加上，传统化学工艺使用大量的有机溶剂、反应条件剧烈，而且不得不采用水蒸汽蒸馏装置，造成能耗大、排放高，致使16,17α-环氧黄体酮的Oppenauer氧化反应已成为整个甾体药物工业发展的瓶颈，因此提供一种能够提高16,17α-环氧黄体酮收率，并且反应温和、能够实现绿色制造的方法已成为亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术就是提供一种反应条件温和、绿色环保，并且能够提高16,17α-环氧黄体酮收率的微生物发酵3-羟基-5烯-16,17α-环氧物制备16,17α-环氧黄体酮的方法。本专利技术的反应路线如下：生物法制备17α-环氧黄体酮的方法，以3-羟基-5烯-16,17α-环氧物为底物，经简单节杆菌ArthrobactersimplexAS1.94一步发酵制备16,17α-环氧黄体酮。本专利技术的简单节杆菌ArthrobactersimplexAS1.94来自中国科学院微生物研究所。所述的生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法，1L水中,发酵培养基还含有以下成分：葡萄糖10～15g,酵母提取物3～5g，玉米浆30～40g，磷酸二氢钾0.8～1.2g，泡敌0.1～0.3g。所述的生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法，1L水中,发酵培养基由以下成分组成：葡萄糖10g,酵母提取物3g，玉米浆30g，磷酸二氢钾0.8g，泡敌0.1g。所述的生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法，发酵培养基的初始pH5.8～8.0。所述的生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法，简单节杆菌的接种量为10～15％。所述的生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法，简单节杆菌的接种量为10％。本专利技术的简单节杆菌ArthrobactersimplexAS1.94通过常规的斜面培养和种子培养，得到转化或发酵用菌。斜面培养斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，琼脂粉20g/L。培养条件：33±1℃培养时间：48h种子培养种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，玉米浆12g/L，磷酸二氢钾2.5g/L。无菌生理盐水洗斜面培养物，制成菌悬液，菌体浓度大于1.0×108CFU/ml，2.5m3种子罐，接种量1％，转速120r/min，通风1:0.5。种子罐压力0.05MPa，培养时间22h。所述的生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法，1L水中，发酵底物3-羟基-5烯-16,17α-环氧物2.5g，发酵培养基由以下成分组成：葡萄糖10g,酵母提取物3g，玉米浆30g，磷酸二氢钾0.8g，泡敌0.1g，在通风机械搅拌发酵罐中配置发酵液，调节初始pH5.8，蒸汽灭菌，冷却至33±1℃，按照10％接种量在无菌条件下接种种子培养液于发酵罐的发酵液中，发酵罐转速80r/min，通风量1:0.5，培养时间72h，转化完毕，90℃发酵液灭活，冷却到室温，板框压滤，滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，即16,17α-环氧黄体酮。本专利技术的有益效果：与传统的化学法制备16,17α-环氧黄体酮相比较，本专利技术提供的一种生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法具有以下优点，1)本专利技术以3-羟基-5烯-16,17α-环氧物为底物，利用简单节杆菌生物发酵制备16,17α-环氧黄体酮，反应条件温和，发酵过程中不使用危险化学品原料，如异丙醇铝、环己酮、甲苯等，实现了16,17α-环氧黄体酮的绿色制造。2)本专利技术简单节杆菌生物发酵制备16,17α-环氧黄体酮的方法，所得16,17α-环氧黄体酮的收率大于90％，纯度大于98.5％，而传统的化学法，在相同的纯度下，16,17α-环氧黄体酮的收率仅为70～73％。附图说明：图1所示为本专利技术制备的16,17α-环氧黄体酮结构紫外光谱鉴定；图2所示为本专利技术制备的16,17α-环氧黄体酮结构红外光谱鉴定；图3所示为本专利技术制备的16,17α-环氧黄体酮ESI-MS质谱图；图4所示为本专利技术制备的16,17α-环氧黄体酮核磁共振H谱；图5所示为本专利技术制备的16,17α-环氧黄体酮核磁共振C谱。具体实施方式：为了更好地理解本专利技术，下面将通过实施例对本专利技术作进一步的描述，这些描述并不是对本
技术实现思路
作进一步的限定。相关技术人员应理解，对本专利技术的技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本专利技术的保护范围之内。实施例1本专利技术的简单节杆菌ArthrobactersimplexAS1.94来自中国科学院微生物研究所，通过斜面培养和种子培养，得到转化或发酵用菌。斜面培养斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，琼脂粉20g/L。培养条件：33±1℃培养时间：48h种子培养种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，玉米浆12g/L，磷酸二氢钾2.5g/L。无菌生理盐水洗斜面培养物，制成菌悬液，菌体浓度大于1.0×108CFU/ml，2.5m3种子罐，接种量1％，转速120r/min，通风1:0.5。种子罐压力0.05MPa，培养时间22h。按照1L水中，发酵底物3-羟基-5烯-16,17α-环氧物2.5g，1L水中,发酵培养基由以下成分组成：葡萄糖10g,酵母提取物3g，玉米浆30g，磷酸二氢钾0.8g，泡敌(消泡剂GPE，江苏斯德瑞克化工有限公司)0.1g，在25m3的通风机械搅拌发酵罐中配置18m3发酵液，调节初始pH5.8，常规湿热蒸汽灭菌，冷却至33±1℃，按照10％接种量在常规无菌条件下接种种子培养液于25m3发酵罐的发酵液中。发酵罐转速80r/min，通风量1:0.5，培养时间72h，取样，TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层乙酸乙酯常压浓缩或挥发至干，HPLC法测定转化结果，3-羟基-5烯-16,17α-环氧物含量1.2％，16,17α-环氧黄体酮含量98.2％，其它物质含量0.6％。转化完毕，90℃发酵液灭活，冷却到室温，板框压滤，滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率98.5％，16,17α-环氧黄体酮含量98.7％。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物法制备16,17α‑环氧黄体酮的方法，其特征在于，以3‑羟基‑5烯‑16,17α‑环氧物为底物，经简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94发酵制备16,17α‑环氧黄体酮。

【技术特征摘要】
1.一种生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法，其特征在于，以3-羟基-5烯-16,17α-环氧物为底物，经简单节杆菌ArthrobactersimplexAS1.94发酵制备16,17α-环氧黄体酮。2.根据权利要求1所述的生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法，其特征在于，1L水中,发酵培养基还含有以下成分：葡萄糖10～15g,酵母提取物3～5g，玉米浆30～40g，磷酸二氢钾0.8～1.2g，泡敌0.1～0.3g。3.根据权利要求2所述的生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法，其特征在于，1L水中,发酵培养基由以下成分组成：葡萄糖10g,酵母提取物3g，玉米浆30g，磷酸二氢钾0.8g，泡敌0.1g。4.根据权利要求2～3任一所述的生物法制备16,17α-环氧黄体酮的法，其特征在于，发酵培养基的初始pH5.8～8.0。5.根据权利要求1～3任一所述的生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法，其特征在于，简单节杆菌的接种量为10～15％。6.根据权利要求5所述的生物法制备16,17α-环氧黄体酮的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张安全，李九州，别松涛，
申请(专利权)人：山东宝利甾体生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37