LNSM蛋白及其编码基因在植物转基因中的应用制造技术

本发明专利技术公开了LNSM蛋白及其编码基因在植物转基因中的应用。本发明专利技术提供了一种蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。本发明专利技术克隆了氮素营养相关的功能基因LNSM，通过将叶绿体定位的LNSM蛋白过表达到番茄M82栽培种之中，增加了转基因植株对低氮环境的适应性，其地上部和地下部的干重有所增加。将LNSM蛋白过表达到单子叶植物水稻之中，也在一定程度上加强了转基因植株的低氮耐受能力。

Application of LNSM protein and its coding gene in plant transgene

The present invention discloses the application of LNSM protein and its coding gene in plant transgene. The present invention provides a protein that is as follows: a) or b) protein: a) amino acid sequence by the sequence 2 in the sequence table shown in protein; b) amino acid sequence sequence in a sequence table 2 with one or several amino acid substitution and deletion and / or Tim and with the same function by a derived protein). The present invention clones function nitrogen nutrition related gene LNSM, the chloroplast localized overexpression of LNSM protein to M82 in tomato cultivation, increase the adaptability of transgenic plants to low nitrogen environment, the shoot and root dry weight increased. Overexpression of the LNSM protein into Oryza sativa also enhanced the low nitrogen tolerance of transgenic plants to some extent.

【技术实现步骤摘要】
LNSM蛋白及其编码基因在植物转基因中的应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及LNSM蛋白及其编码基因在植物转基因中的应用。
技术介绍
氮素是植物生长发育最重要的大量元素之一。氮素的代谢是极其复杂的过程，包括吸收、转运、还原、同化和转移利用。叶绿体对植物氮素的代谢具有十分重要的意义。不仅氮素还原固定的关键反应在叶绿体中进行，叶绿体中含有的丰富蛋白更是整个组织细胞的储备氮源，对植物的生存和逆境抵抗有重要作用。因此，研究叶绿体氮素的生理代谢，明确氮素的吸收、转运和贮藏机制，探索提高氮素利用效率的途径，有助于提高植物尤其是粮食作物产量，促进资源和环境的协调发展。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种蛋白质。本专利技术提供的蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。编码上述蛋白质的DNA分子也是本专利技术的范围。上述DNA分子为如下1)-3)中任一种的DNA分子：1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；2)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码上述蛋白质的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也是本专利技术保护的范围。上述重组载体为将序列表中序列1插入pbi121载体的Xba1和Sac1酶切位点，得到重组载体，命名为pbi121-LNSM；上述重组载体为将序列表中序列1所示的LNSM基因插入PCMBIA1300载体的Bamh1和Sac1酶切位点，且将序列表中序列3所示的35S启动子插入PCMBIA1300载体的Xba1和Bamh1酶切位点，得到重组载体，命名为PCMBIA1300-LNSM，且35S启动子启动LNSM基因。扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物也是本专利技术保护的范围。上述蛋白质或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在调控植物抗逆性中的应用也是本专利技术保护的范围。上述蛋白质或上述DNA分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在培育高抗逆性转基因植物中的应用也是本专利技术保护的范围。上述应用中，所述抗逆性为抗低氮胁迫；低氮为氮浓度为1mM。所述植物为单子叶植物或双子叶植物；或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物为水稻；或所述植物为双子叶植物，所述双子叶植物为番茄。本专利技术另一个目的是提供一种培育高抗逆性转基因植物的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：向目的植物中导入上述DNA分子，得到转基因植物；所述转基因植物的抗逆性高于所述目的植物。上述方法中，所述抗逆性为抗低氮胁迫；低氮为氮浓度为1mM。所述植物为单子叶植物或双子叶植物；或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻；或所述植物为双子叶植物，所述双子叶植物具体为番茄。叶绿体是植物氮素还原、同化和代谢利用的关键功能细胞器。本专利技术从突变体中克隆了氮素营养相关的功能基因LNSM，该基因编码的LNSM蛋白与氮素高效利用密切相关。通过将叶绿体定位的LNSM蛋白过表达到番茄M82栽培种之中，增加了转基因植株对低氮环境的适应性，其地上部和地下部的干重有所增加。将LNSM蛋白过表达到单子叶植物水稻之中，也在一定程度上加强了转基因植株的低氮耐受能力。与传统的转化改良手段相比，本专利技术转化的是与氮素营养密切相关的功能蛋白，该蛋白定位于叶绿体膜，因此能够更加有效的加强叶绿体在氮素代谢中的功能，进而增加植株低氮适应能力。附图说明图1为LNSM基因表达模式和编码蛋白的亚细胞定位；A.野生型番茄Heinz中LNSM基因在各组织的相对表达量。横坐标数字代表叶序；B.野生型番茄Heinz叶片和根中LNSM基因在低氮和高氮条件下的相对表达量。C.LNSM的亚细胞定位。空白：空白质粒转化；LNSM-GFP：LNSM连接GFP绿色荧光蛋白转化；PJIT163-GFP：PJIT163连接GFP蛋白转化。图2为LNSM的番茄转基因过表达研究；A.LNSM转基因番茄表型；B.LNSM转基因番茄干重分析(g)；C.LNSM转基因番茄的RT-PCR验证。图3为LNSM的水稻转基因过表达研究；A.LNSM的转基因水稻表型；B.转基因水稻RT-PCR鉴定结果。1-5为转基因株系，质粒为阳性对照，ck-为非转基因对照；C.LNSM的转基因水稻干重分析(g)。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中Hoagland低氮培养液为在Hoagland-N培养液中加入KNO3得到的混合液，且KNO3在混合液中的浓度为1mM，氮浓度为1mM。表1为Hoagland培养液(pH5.6)实施例1、LNSM的基因克隆和表达模式一、LNSM的基因克隆从番茄自然突变体中筛选出一个低氮处理叶黄化、高氮处理黄化恢复的材料。通过图位克隆获得其目标基因，命名为LNSM(LowNitrogenSensitiveMutantgene)。该基因编码区长度为1644bp，其核苷酸序列为序列表中序列1，编码一个由547个氨基酸组成的蛋白质，其氨基酸序列为序列表中序列2。二、LNSM基因的表达分析组织表达用TrizolRNA提取液提取常规处理的栽培种番茄叶片(自下而上各叶位)、根、茎、花和果实的RNA，用Invitrogen的cDNA反转试剂盒合成cDNA，用Takara公司的SYBRPremixEXTaq荧光定量PCR试剂定量检测LNSM基因表达，扩增引物为F-GTTGTAGTAGTGGTAGTGGTGGTGG和R-CCCATAACTTCTGATAACTGACTCTG。内参为番茄Ubi基因，其扩增引物为F-GGACGGACGTACTCTAGCTGAT和R-AGCTTTCGACCTCAAGGGTA。结果，LNSM在幼叶中表达最高，根中最低(图1A)。提取不同氮素浓度营养液(1mM硝酸钾和40mM硝酸钾)处理的成熟叶和根RNA，经同上的步骤获得cDNA，用同上的方法检测LNSM表达。结果，LNSM的表达不受氮素浓度影响(图1B)。三、LNSM的亚细胞定位将LNSM基因编码序列两端通过引物加入Sal1和Bamh1酶切位点，扩增引物为F-GTCGACATGGGAACTTTAACGAGCTGTAG和R-GGATCCTCAAAAGGTGGTTACAAGACCTATACC。测序正确的DNA片段经Sal1和Bamh1酶切后，与同样经Sal1和Bamh1酶切的pJIT163-GFP载体(HuilanWu,YanyanJi,JuanDu,DanyuKong,HuiLiang,andHong-QingLing.Cl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为如下1)-3)中任一种的DNA分子：1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；2)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码上述蛋白质的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。5.扩增权利要求2或3所述DNA分子全长或其任意片段的引物。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：凌宏清，龙文波，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11