可用于治疗的三甘醇胆甾烯基寡核苷酸制造技术

本发明专利技术提供了一种包括５′－ＯＲ，３′－ＴＥＧ胆甾烯基合成序列和可以药用的载体的组合物，其中，所述序列是ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：５，ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：６，ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：７，ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：８。本发明专利技术还提供了将该组合物用于制备药物的方法，以及利用该组合物诱导细胞中的反应的方法，所述反应包括，但不局限于癌细胞和／或滑膜细胞中细胞增殖的抑制，细胞周期停滞的诱导，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活的诱导，多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割，细胞程序死亡的诱导或细胞外基质－细胞相互作用的调节，或它们的组合。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及胆甾烯基-偶联的寡核苷酸组合物，及其用于抑制细胞增殖，诱导细胞程序死亡，修饰细胞周期进程和调节细胞外基质-细胞相互作用的用途。
技术介绍
增殖是通过细胞周期进行的细胞发展的顶点，导致了一个细胞分裂成两个细胞。细胞周期的五个主要时期是G0，G1，S，G2，和M期。在G0期，细胞是静止的。体内的大部分细胞在某一时间是处在这一阶段的。在G1期，细胞根据信号进行分裂，产生DNA合成所必需的RNA和蛋白质。在S-期(SE，早S-期；SM，中S-期；和SL，晚S-期)，细胞复制它们的DNA。在G2期，蛋白质在致力于细胞分裂的准备。在有丝分裂(M)期，细胞分裂成两个子细胞。细胞周期进程的改变出现在所有癌症中，并且可能是由基因的超量表达，调节基因的突变，或DNA损伤关卡的取消所导致的(Hochhauser D.，Anti-CancerChemotherapeutic Agents，8903，1997)。细胞程序死亡或编程性细胞死亡是杀伤和去除不希望的细胞的生理学过程，并且是化疗剂杀伤癌细胞的机制。细胞程序死亡的特征是细胞内独特的形态学改变，所述改变包括核染色质的凝聚，细胞收缩，核分解，质膜起泡，以及膜结合的细胞程序死亡体的形成(Wyllie等，Int.Rev.Cytol.，68251，1980)。磷脂酰丝氨酸从质膜内表面向外表面的转运，与染色质的凝聚吻合，并且被认为是细胞程序死亡的标志(Koopman，G.等，Blood，841415，1994)。已知细胞程序死亡的机制是通过激活被称为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶家族而介导的。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶将三种主要肽序列认作底物(Thomberry等，J.Biol.Chem.27217907，1997)(i)Tyr-Val-Ala-Asp(YVAD，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1，-4)，(ii)Asp-Glu-Val-Asp(DEVD，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-2，-3和-7)，和(iii)Ile-(Leu)-Glu-X-Asp(I(L)EXD；天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8和-10)。蛋白质目标中的序列识别导致了所述目标的有限的和特异性的蛋白水解，如通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-7，包括但不局限于核纤层蛋白的结构蛋白质目标的降解，或包括但不局限于多腺苷二磷酸核糖聚合酶的酶的激活。据报导，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3能够根据促-细胞程序死亡信号，切割成它的具有催化活性的亚基(17和13kDa)，从而导致细胞程序死亡(Susin等，J.Exp.Med.18625，1997)。在细胞程序死亡期间，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的激活导致了多种底物的蛋白水解切割。多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)——一种参与DNA修复的核内酶，是在细胞程序死亡期间由天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3切割的一种众所周知的底物。它的切割被认为是细胞程序死亡的标志(O′Brien等，Biotechniques 30886，2001)。细胞外基质(ECM)能影响正常细胞和肿瘤细胞的行为(Radisky等，Seminars Cancer Biol.，1187，2001)。因此，当将肿瘤细胞铺平板在ECM上时，肿瘤细胞和ECM成分之间的相互作用将激活模拟体内肿瘤的若干种生物病理学特征的信号传导事件，如细胞-细胞接触的调节(Weaver等，J.Cell Biol.，137231，1997)。合成的寡核苷酸是聚阴离子序列，所述序列被内在化到细胞中(Vlassov等，Biochim.Biophys.Acta，1119795，1994)。据报导，合成的寡核苷酸能选择性地与核酸结合(Wagner，R.，Nature，372333，1994)，与特殊的细胞蛋白质结合(Bates等，J.Biol.Chem.，27426369，1999)，以及与特殊的核蛋白质结合(Scaggiante等，Eur.J.Biochem，252207，1998)，以便抑制癌细胞的增殖。业已描述了具有胆甾烯基部分的寡核苷酸的合成和物理学特征。胆甾烯基部分与反义寡核苷酸的3’末端的连接能增强它们的活性(Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，866553，1989；Boutorin等，FEBS Letter，254129，1989；Corrias等，J.Neurooncol.31171，1997；美国专利号4,958,013；WO专利号9714440)。胆甾烯基部分与3′-末端的连接能增强细胞对反义分子的摄取(Corrias等，J.Neurooncol.31171，1997)，并且增强体内反义血管保持(Fleser等，Circulation 921296，1995)。业已描述了通过氨基磷酸酯键与磷连接的核苷间胆甾烯基侧链是一种能增强反义分子活性的修饰(美国专利号4,958,013)。发现在5′-末端具有胆甾烯基部分的15个胞苷或胸苷残基的均聚物，能调节早幼粒细胞白血病细胞中的细胞质Ca2+水平，而在5′-末端具有胆甾烯基部分的杂聚序列或胆甾烯基修饰过的硫代磷酸序列是无活性的(Saxon等，Antisense Res.Dev.2243，1992)。已显示由15个具有交替的胞嘧啶和腺苷残基的硫代磷酸脱氧核苷酸组成的杂聚物或具有15个胞嘧啶或胸苷均聚物，在胆甾烯基团与它的5′-末端连接时，是氨甲蝶呤转运的有效抑制剂(Henderon等，Nucl.Acids Res.253726，1995)。在5’-末端具有胆甾烯基部分的10个碱基的同型胞苷硫代磷酸寡核苷酸的共价修饰通过抑制HIV逆转录酶，阻断了受HIV-1或HIV-2感染的T淋巴细胞中的合胞体的形成(Stein等，Biochemistry 52439，1991)。胆甾烯基部分与寡核苷酸的附着对癌细胞生长具有最小的作用(Henderon等，Nucl，Acids Res.253726，1995)。细胞程序死亡的一般特征未在用3′-末端胆甾烯基寡核苷酸处理的癌细胞系中观察到(Corrias等，J.Newooncol.31171，1997)。业已证实大部分抗癌治疗，无论是针对增殖抑制，细胞周期停滞的诱导，细胞程序死亡的诱导，免疫系统的刺激还是细胞外基质细胞相互作用的调节，更不适合临床应用。这些治疗方法中的很多是无效的或有毒的，具有明显的副作用，导致抗药性或免疫致敏的形成，并且使受体衰弱。因此，一直需要能在癌细胞中诱导细胞周期停滞的新型组合物和方法，在癌细胞中诱导细胞程序死亡的方法，以及调节细胞外基质-细胞相互作用的方法。专利技术概述本专利技术通过提供一种组合物满足了这一需要，其中，将一个三甘醇(TEG)胆甾烯基部分与合成的寡核苷酸序列SEQ ID NO1(5′OH-GGGTGG-OH 3′)，SEQ ID NO2(5′OH-GGGAGG-OH 3′)，SEQ ID NO3(5′OH-CCACCC-OH 3′)，或SEQ ID NO4(5′OH-GTG-OH 3′)的3’末端附着，得到了相应的5′-OH，3′TEG胆甾烯基新型合成的寡核苷酸序列SEQ ID NO5(5′OH-GGGTGG(TE本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包括５′－ＯＨ，３′－ＴＥＧ胆甾烯基合成序列的组合物，其中，所述序列是ＳＥＱＩＤＮＯ：５，ＳＥＱＩＤＮＯ：６，ＳＥＱＩＤＮＯ：７或ＳＥＱＩＤＮＯ：８。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：安德烈亚克里斯蒂娜赫雷拉盖奥尔，NC菲利普斯，MC菲利安，
申请(专利权)人：拜奥尼茨生命科学公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]