肝癌标志物单克隆抗体的制备及其应用制造技术

本发明专利技术公开了肝癌标志物单克隆抗体的制备及其应用。本发明专利技术涉及针对人肝癌标志物的抗体或其片段(特别是单链抗体)，用于制备它们的方法，包含它们的检测试剂和试剂盒，及其应用。

Preparation and application of monoclonal antibodies against hepatocellular carcinoma markers

The invention discloses a preparation and application of a monoclonal antibody of a liver cancer marker. The present invention relates to antibodies or fragments thereof, in particular to single chain antibodies, for human liver cancer markers, methods for their preparation, detection reagents and kits comprising them, and uses thereof.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及针对人肝癌标志物的抗体或其片段(特别是单链抗体)，用于制备它们的方法，包含它们的检测试剂和试剂盒，及其应用。
技术介绍
原发性肝癌(PLC,简称肝癌)是临床上最常见的恶性肿瘤之一，起病隐匿，侵袭生长迅速，治疗后易复发，预后极差，被称为“癌中之王”。全世界半数左右的肝癌患者集中在中国，每年我国约有11万人死于肝癌，居恶性肿瘤死亡率的第二位。目前，手术切除及肝移植是肝癌最有效的治疗方法，但绝大多数肝癌患者就诊时已到中晚期，无法手术，手术切除率仅为10-30％。对于不能手术的病例，传统的放、化疗效果不佳，患者生存期一般不超过半年。由此可见肝癌早期诊断至关重要，是临床诊疗和预后的关键。早期肝癌检出率低的现状反映出目前肝癌的诊断方法还有很大局限性。当前肝癌的诊断主要依靠血清学检查和影像学诊断。血清学检查主要检测血清中的肿瘤标志物，目前主要是依靠AFP的检测，但AFP在小肝癌中的敏感度仅为40％左右。由此可见，单独使用一种肿瘤标志物无法准确诊断肿瘤的发生和发展，联合检测多种肿瘤标志物才能提高检出的准确率，避免或减少漏诊和假阳性。应用新的检测技术、选择更有诊断价值的标志物组合，提高现有肿瘤标志物检测的灵敏度和特异性对肝癌早期诊断极为重要。目前，常用的肝癌标志物主要包括：甲胎蛋白(AFP)、谷氨酰转移酶同工酶Ⅱ(GGTⅡ)、α-L-岩藻糖甘酶(AFU)、肝细胞生长因子(HGF)、硫酸肝素蛋白多糖3(GPC3)、癌胚抗原(CEA)等。单克隆抗体能识别各种生物活性物质如蛋白、多糖、脂蛋白、神经肽、核酸等的单一抗原决定簇并与其特异性结合，又由于单克隆抗体的均质性极易大量生产，使得单克隆抗体在生命科学研宄领域中得到极为广泛的应用。单链抗体(scFv)是抗体分子中保留抗原结合部分的最小功能片段，分子量约为完整抗体的1/6，是用基因工程方法将抗体重链和轻链可变区通过一段连接肽连接而成的重组蛋白。单链抗体优越性在于可通过包含体大量表达，尤其易于构建抗体融合蛋白，具有分子小、免疫原性低、无Fc端、不易与具有Fc受体的靶细胞结合、对肿瘤组织的穿透力强等特点。利用单克隆抗体和单链抗体，用于早期肝癌的检测，具有无可比拟的优势。
技术实现思路
本专利技术包括特异性结合于人肝癌标志物的抗体或其片段，所述人肝癌标志物选自由以下组成的组：甲胎蛋白(AFP)、谷氨酰转移酶同工酶II(GGTII)、α-L-岩藻糖甘酶(AFU)、肝细胞生长因子(HGF)和硫酸肝素蛋白多糖3(GPC3)。优选所述抗体为单克隆抗体，其特征在于包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中a)对于针对AFP的抗体，所述轻链可变结构域包含SEQIDNO:21的CDR1区,SEQIDNO:22的CDR2区和SEQIDNO:23的CDR3区,并且所述重链可变结构域包含SEQIDNO:24的CDR1区,SEQIDNO:25的CDR2区和SEQIDNO:26的CDR3区；b)对于针对AFU的抗体，所述轻链可变结构域包含SEQIDNO:27的CDR1区,SEQIDNO:28的CDR2区和SEQIDNO:29的CDR3区,并且所述重链可变结构域包含SEQIDNO:30的CDR1区,SEQIDNO:31的CDR2区和SEQIDNO:32的CDR3区；c)对于针对GGTII的抗体，所述轻链可变结构域包含SEQIDNO:33的CDR1区,SEQIDNO:34的CDR2区和SEQIDNO:35的CDR3区,并且所述重链可变结构域包含SEQIDNO:36的CDR1区,SEQIDNO:37的CDR2区和SEQIDNO:38的CDR3区；d)对于针对HGF的抗体，所述轻链可变结构域包含SEQIDNO:39的CDR1区,SEQIDNO:40的CDR2区和SEQIDNO:41的CDR3区,并且所述重链可变结构域包含SEQIDNO:42的CDR1区,SEQIDNO:43的CDR2区和SEQIDNO:44的CDR3区；和e)对于针对GPC3的抗体，所述轻链可变结构域包含SEQIDNO:45的CDR1区,SEQIDNO:46的CDR2区和SEQIDNO:47的CDR3区,并且所述重链可变结构域包含SEQIDNO:48的CDR1区,SEQIDNO:49的CDR2区和SEQIDNO:50的CDR3区。优选地，所述抗体或其片段其特征在于包含：a)SEQIDNO：1的轻链可变结构域和SEQIDNO：2的重链可变结构域；b)SEQIDNO：3的轻链可变结构域和SEQIDNO：4的重链可变结构域；c)SEQIDNO：5的轻链可变结构域和SEQIDNO：6的重链可变结构域；d)SEQIDNO：7的轻链可变结构域和SEQIDNO：8的重链可变结构域；或e)SEQIDNO：9的轻链可变结构域和SEQIDNO：10的重链可变结构域。优选地，所述抗体或其片段其特征在于所述抗体是人IgG2亚类、人IgG1亚类或人IgM亚类的。优选地，所述片段是单链抗体(scFv)。本专利技术的另一个实施方案是包含本专利技术所述的抗体或其片段的测定或诊断用试剂盒或试剂。优选地，所述试剂盒或试剂用于ELISA测定、WesternBlotting测定、免疫组织化学测定或免疫荧光测定，特别是用于诊断肝癌。本专利技术的另一个实施方案是本专利技术所述的抗体或其片段在制备测定或诊断用试剂盒或试剂中的应用，优选所述试剂盒或试剂用于ELISA测定、WesternBlotting测定、免疫组织化学测定或免疫荧光测定，特别是用于诊断肝癌。本专利技术的另一个实施方案是编码本专利技术所述的抗体或其片段的核酸。本专利技术的另一个实施方案是包含本专利技术所述的核酸的表达载体，优选所述载体用于在原核宿主细胞或真核宿主细胞中表达特异性结合于人肝癌标志物的抗体或其片段，所述人肝癌标志物选自由以下组成的组：甲胎蛋白(AFP)、谷氨酰转移酶同工酶II(GGTII)、α-L-岩藻糖甘酶(AFU)、肝细胞生长因子(HGF)和硫酸肝素蛋白多糖3(GPC3)。本专利技术的另一个实施方案是包含本专利技术所述的载体的原核宿主细胞或真核宿主细胞。本专利技术还包括用于产生根据本专利技术所述的重组人或人源化的抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达根据本专利技术所述的核酸，并且从所述细胞或细胞培养上清液中回收所述抗体。本专利技术还包括可通过所述重组方法获得的抗体。根据本专利技术所述的抗体或其片段特别用于ELISA测定、WesternBlotting测定、免疫组织化学测定或免疫荧光测定，特别是用于诊断肝癌。专利技术详述本专利技术公开了针对五种肝癌标志物的单克隆抗体和单链抗体，及其制备方法和科研医疗用途，属于细胞工程
它们以市售AFP和本实验室制备的HGF、AFU、GGTⅡ、GPC3融合蛋白为抗原，免疫Balb/c小鼠得到分泌抗体的B细胞，与骨髓瘤细胞融合后筛选具有分泌单克隆抗体的融合细胞；所制备单克隆抗体能很好应用于ELISA、WesternBlotting、免疫组织化学、免疫荧光等对相应抗原的检测；此外，本专利技术还利用基因工程方法分别制备了只含有每种抗体重链可变区和轻链可变区的单链抗体(ScFv)，所构建的单链抗体具有分子小、免疫原性低、无Fc端、对肿瘤组织的穿透力强等特点。将这些抗体联用，有望开发出应用于肝癌患者早期血清学诊断的有效试剂盒。具本文档来自技高网...

【技术保护点】
特异性结合于人肝癌标志物的抗体或其片段，所述人肝癌标志物选自由以下组成的组：甲胎蛋白(AFP)、谷氨酰转移酶同工酶II(GGT II或GGT2)、α‑L‑岩藻糖甘酶(AFU)、肝细胞生长因子(HGF)和硫酸肝素蛋白多糖3(GPC3)。

【技术特征摘要】
1.特异性结合于人肝癌标志物的抗体或其片段，所述人肝癌标志物选自由以下组成的组：甲胎蛋白(AFP)、谷氨酰转移酶同工酶II(GGTII或GGT2)、α-L-岩藻糖甘酶(AFU)、肝细胞生长因子(HGF)和硫酸肝素蛋白多糖3(GPC3)。2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，优选所述抗体为单克隆抗体，其特征在于包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中a)对于针对AFP的抗体，所述轻链可变结构域包含SEQIDNO:21的CDR1区,SEQIDNO:22的CDR2区和SEQIDNO:23的CDR3区,并且所述重链可变结构域包含SEQIDNO:24的CDR1区,SEQIDNO:25的CDR2区和SEQIDNO:26的CDR3区；b)对于针对AFU的抗体，所述轻链可变结构域包含SEQIDNO:27的CDR1区,SEQIDNO:28的CDR2区和SEQIDNO:29的CDR3区,并且所述重链可变结构域包含SEQIDNO:30的CDR1区,SEQIDNO:31的CDR2区和SEQIDNO:32的CDR3区；c)对于针对GGTII的抗体，所述轻链可变结构域包含SEQIDNO:33的CDR1区,SEQIDNO:34的CDR2区和SEQIDNO:35的CDR3区,并且所述重链可变结构域包含SEQIDNO:36的CDR1区,SEQIDNO:37的CDR2区和SEQIDNO:38的CDR3区；d)对于针对HGF的抗体，所述轻链可变结构域包含SEQIDNO:39的CDR1区,SEQIDNO:40的CDR2区和SEQIDNO:41的CDR3区,并且所述重链可变结构域包含SEQIDNO:42的CDR1区,SEQIDNO:43的CDR2区和SEQIDNO:44的CDR3区；和e)对于针对GPC3的抗体，所述轻链可变结构域包含SEQIDNO:45的CDR1区,SEQIDNO:46的CDR2区和SEQIDNO:47的CDR3区,并且所述重链可变结构域包含SEQIDNO:48的CDR1区,SEQIDNO:49的CDR2区和SEQIDNO:50的CDR3区。3.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宁，罗艺，
申请(专利权)人：天津医科大学，
类型：发明
国别省市：天津;12