结合尿激酶纤溶酶原激活物的抗体制造技术

本发明专利技术涉及鉴定尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)抗体的方法。本发明专利技术也涉及能够结合uPA和能够减少或抑制uPA活性的抗体。此外，本发明专利技术涉及所述抗体的用途，例如治疗和药学用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术
本专利技术涉及鉴定尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)抗体的方法。本专利技术也涉及能够结合uPA并能够抑制或阻断uPA活性的抗体。此外，本专利技术涉及这类抗体的用途，例如治疗和药物用途。专利技术背景尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)是一种胞外丝氨酸蛋白酶。UPA由3个结构域组成：1)生长因子结构域(GFD)，其介导uPA与其受体uPAR结合；2)uPA的三环结构域(kringledomain)，其被描述为与整联蛋白相互作用；和3)催化结构域，其介导uPA的蛋白水解功能。uPA的主要蛋白水解功能是将无活性的酶原纤溶酶原(Plg)转化为有活性的丝氨酸蛋白酶纤溶酶。UPA作为单链酶原(sc-uPA)产生，其在Lys158-Ile159肽键(相对于人sc-uPA的编号)被内蛋白水解性切割(endoproteolyticallycleaved)。所得的双链形式的uPA(tc-uPA)由单一的二硫桥连接在一起。相比tc-uPA，sc-uPA的蛋白水解活性是最小的，但sc-uPA却具有某些固有的蛋白水解活性。uPA的催化结构域以有活性和无活性构象的两种结构构象的平衡状态存在。在sc-uPA中，催化结构域的无活性构象是有利的。Lys158-Ile159肽键的水解改变了这些结构构象之间的动态平衡，以有助于活性形式(Jiang等人,Biochem.J.449：161–166,2013)。在健康生物体中，尿道和胃肠道外的uPA的存在通常限于循环粒细胞和经历重塑的组织中的某些细胞种类。在疾病期间，也发现uPA在炎性病症和癌症病灶的部位。动物研究已经证明了uPA在癌症和在炎性病症(包括关节炎疾病)中的功能性作用。因此拮抗uPA在癌症和炎性疾病(例如类风湿性关节炎和银屑病性关节炎)的治疗中是合意的。专利文件US8062637和WO03033009提供了uPA在关节炎疾病中的功能性作用的实验证据。所述文件进一步描述了在受试者中改善炎性疾病的效果的方法，包括将拮抗剂给予受试者，所述拮抗剂包括特异性地结合uPA的抗体。文件US8062637和WO03033009描述了结合uPA的抗体的可能用途，但是这些文件都没有描述或提供结合uPA的任何抗体的数据。专利文件WO2006050177描述了鉴定抗uPA抗体的方法以及这些抗体在治疗炎性疾病中的潜在用途，所述抗体对对应于uPA的三环结构域的86个氨基酸长度的表位具有特异性。WO2006050177专利文件没有描述或提供结合uPA的任何抗体的数据。此外，预测结合至三环结构域的抗体对uPA的蛋白水解功能无作用，因为uPA的蛋白水解性能主要与催化结构域相关。专利文件WO2005048822描述了两种抗uPA抗体，ATN-291和ATN-292，其特异性地结合至uPA的生长因子结构域(GFD)(ATN-292)和三环结构域(ATN-291)。WO2005048822专利文件进一步描述了这些抗体对于治疗癌症或其它疾病的潜在用途。预测结合至GFD或三环结构域的抗体对uPA的蛋白水解功能无作用，因为uPA的蛋白水解性质主要与催化结构域相关。专利文件US5496549描述了双特异性抗体，其中两个特异性之一是被三种抗uPA抗体(UK1-3、UK1-87和UK1-6)中的任一个赋予的。另一特异性针对血小板表面蛋白并且该专利进一步描述了这些双特异性抗体递送活性生物物质(在本案中是uPA)的潜在用途，用于治疗血栓形成或其它心血管疾病。这三种抗体都不抑制uPA的蛋白水解活性，但经设计在血小板沉积部位递送或浓缩uPA。如上所述，结合uPA的抗体是已知的；和它们在炎性疾病的治疗中的用途已经被设想(envisaged)。然而迄今为止，抗uPA抗体尚未进入临床试验。因此，对于治疗性抗uPA抗体，仍然有未满足的需要，例如用于炎性疾病患者或癌症患者。本文公开的是具有新的特征的抗uPA抗体。这些抗体适合于药物开发。这样的抗体对患有癌症或炎性疾病的个体的生活质量可能具有重要影响。专利技术概述本专利技术涉及能够结合至人uPA的抗体或其抗原-结合片段，其特征在于它们抑制uPA的蛋白水解活性形式的蛋白水解活性和抑制单链uPA(sc-uPA)自uPA的蛋白水解无活性形式至uPA的蛋白水解活性形式的激活。首次，鉴定了对于人uPA具有特异性的抑制性单克隆抗体，其具有该双重功能性。这些抗体抑制(活性)纤溶酶所致的uPA的酶原形式sc-uPA激活，和同时所述抗体抑制双链uPA(tc-uPA)朝向(无活性)酶原纤溶酶原的蛋白水解活性。所述抗体因此同时抑制sc-uPA和纤溶酶原之间的相互的酶原激活环的蛋白水解反应，提供更强效的总体蛋白水解级联反应的抑制。相比仅抑制tc-uPA的蛋白水解活性的抗体，双重作用抗体的优势以一组小鼠抗体，mU1和mU3来说明。在基于细胞的测定和在体内小鼠模型中(Lund等人,J.Biol.Chem.283：32506-32515,2008)，相比mU3，双重作用小鼠抗体mU1具有结合小鼠uPA和抑制小鼠tc-uPA蛋白水解功能的类似活性，但具有功能性地抑制小鼠uPA活性的优越能力。这些抗体对小鼠uPA具有特异性，并因此预期不结合人uPA，因此不适用于本申请的范围内。它们与本专利技术所述的抗uPA抗体不具有所有的相同的新的特征或药物开发的可能性。已经公布了若干现有技术抗uPA抗体在人uPA或在小鼠uPA上的结合部位(Jiang等人,2013,BiochemJ449,161-166；Kromann-Hansen等人,2013,Biochemistry52,7114-7126)。我们描述了结合至人uPA上的新的表位的双重作用抗uPA抗体，并且证明了该抗体诱导贯穿人uPA多肽的协同构象变化，其涉及uPA的所有三个主要结构域(GFD、三环和催化结构域)中的氨基酸。除了新的表位和新的抑制所述酶的方式外，该跨越结构域的构象变化也是空前的。本专利技术的一方面，所述抗体能够结合至和抑制受体-结合的uPA和非-受体-结合的uPA两者。这增加了优势，因为uPA的某些蛋白水解功能被证明依赖于结合至uPA受体uPAR，而uPA的其它蛋白水解功能被证明是独立于uPAR。专利文件WO03033009A中公开的数据说明了uPA在小鼠关节炎模型中的作用，其可能依赖于uPAR并且也依赖于uPA的蛋白水解活性。能够抑制受体-结合的uPA和非-受体-结合的uPA两者的功能的抗体因此具有优势，因为uPA的所有形式都将被这样的抗体抑制，和不知道对于本文所述的任何指定人类疾病，uPA的疾病相关功能依赖于结合至uPAR的程度如何。鉴定抑制本文档来自技高网...

【技术保护点】
能够结合至人uPA的抗体或其抗原‑结合片段，其特征在于它抑制人tc‑uPA的蛋白水解活性和抑制人sc‑uPA自人uPA的蛋白水解无活性形式至人uPA的蛋白水解活性形式的激活。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.07.15 EP 13176519.0;2013.07.18 US 61/8476641.能够结合至人uPA的抗体或其抗原-结合片段，其特征在于它抑制人tc-uPA的蛋白水
解活性和抑制人sc-uPA自人uPA的蛋白水解无活性形式至人uPA的蛋白水解活性形式的激
活。
2.权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体抑制受体-结合的人uPA和非-受体-结合
的人uPA两者。
3.权利要求1-2中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体还抑制tc-uPA的蛋
白水解活性和/或抑制sc-uPA自uPA的蛋白水解无活性形式至uPA的蛋白水解活性形式的激
活，其中uPA是来自其它物种，例如黑猩猩、食蟹猴、恒河猴、小鼠、大鼠、兔、牛、绵羊、猪或骆
驼的uPA。
4.权利要求1、2或3的抗体或其抗原-结合片段，其结合至人uPA(SEQIDNO：1)上的
不连续表位/结合区，其中所述不连续表位/结合区的第一结合部分被SEQIDNO：1的氨基
酸编号167-175所限定，和所述不连续表位/结合区的第二结合部分被SEQIDNO：1的氨基
酸编号218-224所限定。
5.权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的重链包含：
SEQIDNO：7的氨基酸残基31(Kabat和sequential)至35(Kabat和sequential)
(SYTMS)的CDR1序列；和/或
SEQIDNO：7的氨基酸50(Kabat和sequential)至65(Kabat；66sequential)
(TISGGGSHIYYADSVKG)的CDR2序列；和/或
SEQIDNO：7的氨基酸残基95(Kabat；99sequential)至102(Kabat；108
sequential)(DGRDGSWFAY)的CDR3序列，其中D95(Kabat；99sequential)可以突变为除
了D的任何氨基酸，和/或G96(Kabat；100sequential)可以突变为除了G的任何氨基酸，
和/或D98(Kabat；102sequential)可以突变为除了D的任何氨基酸，和/或G99(Kabat；
103sequential)可以突变为除了G的任何氨基酸。
6.权利要求1-5中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的轻链包含：
SEQIDNO：8的氨基酸残基24(Kabat和sequential)至34(Kabat和sequential)
(RTSQSIGDYLH)的CDR1序列；和/或
SEQIDNO：8的氨基酸残基50(Kabat和sequential)至56(Kabat和sequential)
(YVSQSIS)的CDR2序列；和/或
SEQIDNO：8的氨基酸残基89(Kabat和sequential)至97(Kabat和sequential)
(QNSHSFPLT)的CDR3序列，其中这些氨基酸残基中的1或2个可以被不同的氨基酸取代，尤其
是N90可以突变为除了N的任何氨基酸，和/或S91可以突变为除了S的任何氨基酸。
7.权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原-结合片段，其中所述抗体的重链包含：
SEQIDNO：7的氨基酸残基31(Kabat和sequential)至35(Kabat和sequential)
(SYTMS)的CDR1序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：S帕德克杰，J帕斯，G罗德，K阿姆霍特，PA厄，
申请(专利权)人：诺和诺德股份有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK