本发明专利技术公开了一种抗人α‑烯醇化酶(ENO1)抗体，其可结合含人ENO1蛋白(Genbank：AAH50642.1)的氨基酸序列296FDQDDWGAWQKFTA309(SEQ ID NO:9)和/或326KRIAKAVNEKS336(SEQ ID NO:10)的肽，具有良好的结合活性(结合亲和力约为2.19×10‑10mol/L)和显著的抑制各种肿瘤的细胞侵袭和肿瘤转移的能力。本发明专利技术鉴别的肽和抗体可用于已报道在细胞表面表达ENO1的癌症(如，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、结直肠癌、前列腺癌和实体瘤)的诊断、预后和治疗。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及特异性结合人α-烯醇化酶蛋白(ENO1)的抗体的生产和使用方法。专利技术背景肿瘤产生于单个细胞的异常、无限制增殖产生的转化细胞繁殖系。肿瘤细胞可表达独特的可被免疫系统识别的抗原。肿瘤相关的抗原包括突变的致癌基因、突变的正常细胞蛋白，异常表达的细胞蛋白，异常的细胞表面蛋白，以及致癌性病毒蛋白。免疫系统将这些肿瘤相关的抗原识别为非自身抗原，并可产生抗体以清除携带这些外源抗原的肿瘤细胞，同时留下健康细胞。因此，鉴别出免疫原性肿瘤相关抗原，可用作癌症治疗中临床预后或治疗应用的靶标。可由肺与胸壁之间的过量体液，即胸腔积液来鉴别某些恶性肿瘤。肺癌、乳腺癌以及淋巴瘤引起的恶性胸腔积液约占全部恶性胸腔积液的75％。恶性胸腔积液可能富含有淋巴细胞浸润物和肿瘤细胞。已在积液中发现了肿瘤相关免疫复合物或自身抗体，如抗p53抗体、抗核抗体和抗L-Myc抗体，且已发现这些复合物或自身抗体与差的预后有关。还已在恶性积液中鉴别到几种肺部肿瘤相关的抗原，包括细胞角蛋白19的片段，神经元特异性烯醇化酶(ENO2)，鳞状细胞癌抗原以及可溶性HLA-I等。α-烯醇化酶(烯醇化酶-1，ENO1)是个多功能蛋白，最初发现是糖酵解通路中的一个关键的酶。在正常条件下，ENO1表达在细胞溶质中。但是，也发现ENO1表达在许多癌细胞的细胞表面上，作为血纤维蛋白溶酶原的受体，以及表达在活化的造血细胞如中性白细胞、淋巴细胞和单核细胞上。已知血纤维蛋白溶酶原受体蛋白的上调可诱导尿激酶血纤维蛋白溶酶原活化系统(uPAS)的级联反应。尿激酶血纤维蛋白溶酶原活化系统(uPAS)由尿激酶血纤维蛋白溶酶原活化因子(uPA)、其同源受体(uPAR)以及两个特异性抑制剂(血纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂1(PAI-1)与血纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂2(PAI-2))组成。尿激酶血纤维蛋白溶酶原活化因子将血纤维蛋白溶酶原转换成一种活化的丝氨酸蛋白酶，即血纤维蛋白溶酶。血纤维蛋白溶酶参与许多组织重塑过程，例如基底膜(BM)和胞外基质(ECM)重塑，这些都是肿瘤生长和移转所需要的。此外，已显示uPAS可能会参与到肿瘤发展，影响肿瘤血管生成，恶性肿瘤细胞增生、黏附与迁移，内部的血管形成以及在转移部位的生长。具体而言，血纤维蛋白溶酶原的活化可导致胞外基质降解，这反过来会引起癌细胞转移增加以及免疫细胞的浸润。换言之，表达在癌细胞表面上的作为血纤维蛋白溶酶原受体的ENO1可增加癌细胞的侵袭活性。因此，ENO1是潜在的癌治疗靶标。
技术实现思路
本专利技术的实施方案涉及特异性结合人ENO1，从而抑制配体(如血纤维蛋白溶酶原)结合ENO1的靶向结合剂。通过抑制血纤维蛋白溶酶原与ENO1的结合，本专利技术的靶向结合剂能抑制血纤维蛋白溶酶原活化，引起减少的胞外基质降解，这反过来能预防或降低癌细胞从胞外基质脱离。因此，本专利技术各实施方案中的靶向结合剂可用于抑制肿瘤生长和转移。可实现上述作用的机制可包括但不限于抑制配体(如血纤维蛋白溶酶原)与其受体ENO1的结合，或消除受体ENO1与其配体之间的相互作用，从而减少ENO1的有效浓度。根据本专利技术的一个实施方案，靶向结合剂是可结合人ENO1以阻止其配体(如血纤维蛋白溶酶原)与ENO1结合的抗体。阻止血纤维蛋白溶酶原与其受体的结合可预防血纤维蛋白溶酶原活化。这导致癌细胞的胞外基质中的尿激酶血纤维蛋白溶酶原活化系统(uPAS)被抑制。根据本专利技术的某些实施方案，抗体可以高亲和力结合ENO1，如以低于0.3nM的Kd结合。这类紧密结合剂可高效抑制ENO1。根据本专利技术的某些实施方案，靶向结合剂是可结合人ENO1并高效抑制(例如80％、90％或100％抑制)癌细胞上诱导的血纤维蛋白溶酶活性的抗体。可使用10微克/mL脂多糖(LPS)处理癌细胞(如U937人淋巴瘤细胞)5小时，诱导该癌细胞中ENO1表达，从而进行抑制分析。可使用合适浓度的抗体检测这种诱导的血纤维蛋白溶酶活性抑制。使用本专利技术的抗体，可在低至20微克/ml甚至更低的抗体浓度检测到这种抑制效果。根据本专利技术的某些实施方案，靶向结合剂是可结合人ENO1的抗体。这种抗体可用于抑制癌细胞的侵袭活性。例如，本专利技术抗体可在其浓度低至50微克/毫升或更低时抑制人非小细胞肺癌CL1-5细胞50％、60％或70％以上的侵袭活性。根据本专利技术的某些实施方案，靶向结合剂是能结合人ENO1以抑制胞外基质降解，进而抑制癌细胞从细胞外基质脱离的抗体。例如，本专利技术抗体可在其浓度低至50微克/毫升或更低时抑制40％、50％或60％以上的血纤维蛋白溶酶原介导的CL1-5细胞与胶原蛋白或纤连蛋白的脱离。根据本专利技术的实施方案，靶向结合剂(如抗体)可包含具有互补决定区(CDR)的重链氨基酸序列，该重链氨基酸序列含有序列1中所含CDR序列中的一条CDR序列。根据本专利技术的某些实施方案，靶向结合剂(如抗体)可包含具有互补决定区(CDR)的轻链氨基酸序列，该轻链氨基酸序列含有序列2中所含的CDR序列中的一条CDR序列。根据本专利技术的某些实施方案，靶向结合剂是抗体，该抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。根据本专利技术的某些实施方案，可结合人ENO1蛋白的抗体含有轻链氨基酸序列，该轻链氨基酸序列含有序列2中所含的LCDR1、LCDR2或LCDR3序列中的任意一个。根据本专利技术的某些实施方案，可结合人ENO1蛋白的抗体含有轻链氨基酸序列，该轻链氨基酸序列含有序列2中所含的LCDR1、LCDR2或LCDR3序列中的任意两个，即LCDR1与LCDR2、LCDR1与LCDR3或LCDR2与LCDR3。根据本专利技术的某些实施方案，可结合人ENO1蛋白的抗体含有轻链氨基酸序列，该轻链氨基酸序列含有序列2中所含的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。根据本专利技术的某些实施方案，抗体可以是人源化抗体或完全人单克隆抗体。根据本专利技术的某些实施方案，可结合人ENO1蛋白的抗体含有重链氨基酸序列，该重链氨基酸序列含有序列1所含的HCDR1、HCDR2或HCDR3序列中的任意一个。根据本专利技术的某些实施方案，可结合人ENO1蛋白的抗体含有重链氨基酸序列，该重链氨基酸序列含有序列1中所含的HCDR1、HCDR2或HCDR3序列中的任意两个，即HCDR1与HCDR2、HCDR1与HCDR3或HCDR2与HCDR3。根据本专利技术的某些实施方案，可结合人ENO1蛋白的抗体含有重链氨基酸序列，该重链氨基酸序列含有序列1中所含的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列。根据本专利技术的某些实施方案，抗体可以是人源化抗体或完全人单克隆抗体。根据本专利技术的某些实施方案，可结合人ENO1蛋白的抗体含有具有CDR的轻链氨基酸序列，该CDR含有序列2所含CDR序列中的一个CDR。根据本专利技术的某些实施方案，可结合人ENO1蛋白的抗体含有具有CDR的重链氨基酸序列，该CDR含有序列1所含CDR序列中的一个CDR。根据本专利技术的某些实施方案，抗体可以是人源化抗体或完全人单克隆抗体。根据本专利技术的某些实施方案，可结合人ENO1蛋白的抗体含有具有序列1所含CDR序列中的一条CDR序列的重链氨基酸序列和具有序列2所含CDR序列中的一条CDR序列的轻链氨基酸序列。根据本专利技术的某些实施方案，抗体可以是人源化抗体或完全人单克隆抗体本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗体或其scFv或Fab片段，包含一条或多条选自下组的序列：HCDR1(GYTFTSCVMN；SEQ ID NO:3),HCDR2(YINPYNDGTKYNEKFKG；SEQ ID NO:4),HCDR3(EGFYYGNFDN；SEQ ID NO:5),LCDR1(RASENIYSYLT；SEQ ID NO:6),LCDR2(NAKTLPE；SEQ ID NO:7),和LCDR3(QHHYGTPYT；SEQ ID NO:8)。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种抗体或其scFv或Fab片段，包含一条或多条选自下组的序列：HCDR1(GYTFTSCVMN；SEQIDNO:3),HCDR2(YINPYNDGTKYNEKFKG；SEQIDNO:4),HCDR3(EGFYYGNFDN；SEQIDNO:5),LCDR1(RASENIYSYLT；SEQIDNO:6),LCDR2(NAKTLPE；SEQIDNO:7),和LCDR3(QHHYGTPYT；SEQIDNO:8)。2.如权利要求1所述的抗体或其scFv或Fab片段，包含重链，所述重链含有HCDR1(GYTFTSCVMN；SEQIDNO:3),HCDR2(YINPYNDGTKYNEKFKG；SEQIDNO:4),和HCDR3(EGFYYGNFDN；SEQIDNO:5)的序列。3.如权利要求2所述的抗体或其scFv或Fab片段，其中所述重链含有SEQIDNO:1的序列。4.如权利要求1所述的抗体或其scFv或Fab片段，包含轻链，所述轻链含有LCDR1(RASENIYSYLT；SEQIDNO:6),LCDR2(NAKTLPE；SEQIDNO:7),和LCDR3(QHHYGTPYT；SEQIDNO:8)的序列。5.如权利要求4所述的抗体或其scFv或Fab片段，其中所述轻链含有SEQIDNO:2的序列。6.如权利要求1所述的抗体或其scFv或Fab片段，含有重链和轻链，所述重链含有HCDR1(GYTFTSCVMN；SEQIDNO:3),HCDR2(YINPYNDGTKYNEKFKG；SEQIDNO:...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡士昌，施能耀，阮大同，刘柯俊，曾世祺，胡智湧，王欣韵，陈立宗，
申请(专利权)人：财团法人生物技术开发中心，国家卫生研究院，DCB美国有限责任公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71
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