本发明专利技术涉及一种预防和治疗骨质疏松、高钙血症、Ｐａｇｅｔ’ｓ病等骨与钙代谢疾病的结构如下的新型双膦酸衍生物。该化合物一般采用取代芳香胺与原甲酸三乙酯及亚膦酸二甲基酯共热制得。反应物摩尔比为：芳香胺∶原甲酸三乙酯∶亚膦酸二甲基酯１∶１－１．５∶３－５，在１００℃－１６０℃加热反应１－３小时。然后抽干过量反应物得到不同的目标产物。本发明专利技术所提供的化合物副作用小，不但对骨吸收有较好的抑制作用，对骨形成还有促进作用，具有双重作用的特点。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及以预防和治疗骨质疏松、高钙血症、Paget’s病等骨与钙代谢疾病为目的而开发的新型双膦酸衍生物。
技术介绍
人类即将进入一个前所未有的老龄化社会，而我国，到2000年60岁以上人口达到11％，作为老年常见病之一的骨质疏松等骨与钙代谢疾病的增加成为一个巨大的社会问题。这类疾病的显著特征是骨吸收因病理或生理原因超过骨的形成而造成单位体积内骨量减少，骨强度减弱，血钙含量升高等病症。自阿伦膦酸等含氮双膦酸临床上广泛应用于骨质疏松等骨与钙代谢疾病以来，含氮双膦酸类化合物因其独特的作用机制倍受关注。相继开发了利塞膦酸、唑伦膦酸等第三代药物。但从临床应用情况来看，疗效和副作用都未得到显著改善。其作用机制表明这些药物只是作用于破骨细胞，抑制骨吸收而对成骨细胞介导的骨形成没有影响。因此至今尚未找到一类对预防和治疗骨质疏松、高钙血症、Paget’s病等骨与钙代谢疾病效果显著的药物。
技术实现思路
本专利技术目的是寻找一类效果更好，副作用更小的双膦酸衍生物。本专利技术提供一类结构如下的新型双膦酸衍生物。体外筛选结果发现这类化合物不但对骨吸收有较好的抑制作用，还显示出对骨形成的促进作用，具有双重作用的特点。 其中R1为一个或两个卤素、烷基、烷氧基、COOH、NH2、NO2、4-NHCH(PO3(CH3)2)2、4-NHCH(PO3H2)2等；R2为H或CH3。本专利技术采用如下化学反应来实施 一般采用取代芳香胺与原甲酸三乙酯及亚膦酸二甲基酯共热制得。反应物摩尔比为芳香胺∶原甲酸三乙酯∶亚膦酸二甲基酯1∶1-1.5∶3-5，在100℃-160℃加热反应1-3小时。然后抽干过量反应物得到不同的目标产物。如果希望获得相应的游离酸，则可进一步用浓盐酸水解得到。含氨基的化合物可通过相应的硝基化合物得到。通常采用钯碳、Renny Ni、硼氢化钠、硼氢化钾等催化剂进行氢化或直接还原获得，如 本专利技术采用上述反应制得的化合物如表1。表1 化合物B1-B24结构一览表编号 R1R2编号 R1R2B1 4-CH3CH3B13 3-NO2CH3B2 4-CH3H B14 3-NO2HB3 4-I CH3B15 4-NO2CH3B4 4-I H B16 4-NO2HB5 4-COOH CH3B17 4-OCH3CH3B6 4-COOH H B18 4-OCH3HB7 4-ClCH3B19 2-CH3-4-NO2CH3B8 4-ClH B20 2-CH3-4-NO2HB9 4-BrCH3B21 4-NHCH(PO3(CH3)2)2CH3B104-BrH B22 4-NHCH(PO3H2)2HB113-COOH CH3B23 2-CH3-4-NH2HB124-C4H9H B24 3-NH2CH3本专利技术采用下列药理实验证明一类芳香含氮双膦酸衍生物具有明显的对成骨细胞和破骨细胞作用。可以在预防和治疗骨质疏松、高钙血症、Paget’s病等骨与钙代谢疾病中应用。药理实验骨质疏松等骨与钙代谢疾病的发生主要是由于骨质形成明显低于骨质吸收的速度而造成病理学的改变。这一过程主要是成骨细胞和破骨细胞的作用。成骨细胞具有合成、分泌骨基质，参与类骨质钙化等功能，对骨的形成有着重要的影响；破骨细胞在骨的吸收中起着关键的作用，也是形成骨质疏松等疾病的主要原因之一。我们选择来源方便、经济的实验动物骨细胞，针对性地进行体外培养。以细胞增殖以及成骨细胞合成I型胶原、分泌碱性磷酸酶(AKP)和骨钙素(BGP)为检测指标判断化合物对成骨细胞的作用；以培养液中抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)活性、钙浓度的测定、骨片特异性染色计数判断化合物对破骨细胞抑制作用。实验方法1成骨细胞的获得和培养24h内新生大鼠，在无菌条件下，取头盖骨，去除周围组织，清洗后剪碎，用胰酶消化30分钟，离心后吸出上清夜，沉淀细胞用培养液(DMEM)稀释，制备成细胞悬液接种于培养瓶，移至5％二氧化碳培养箱中，37℃进行培养。24h后，在倒置显微镜下可见细胞贴壁生长，呈三角形、纺锤形、多角形等多种形态，以后细胞体积增大，数量增多，融合呈铺石状排列。以后每3天换一次培养液，待细胞生长达一定数量后传代，取继代成骨细胞，供药理实验用。2破骨细胞的获得和培养(1)骨片的制备新鲜灭活成人长骨用钢锯或锯式切片机(LEITZ 1600德国生产)切成50(m厚，再用剪刀剪成5×5mm大小，用超声波清洗后，常规消毒。(2)破骨细胞的培养24h内新生鼠，在无菌条件下取四肢，分离股骨、肱骨和胫骨，去除骨表面的软组织和骨髓，在培养液中将骨干纵向剖开，用解剖刀将骨质轻轻刮入培养液内，用吸管反复吹打骨质碎片，使附着于碎骨片上的破骨细胞游离出来，过滤、离心，制成细胞悬液，接种于含骨片的孔板中，5％二氧化碳条件下37℃培养30分钟，冲洗未贴壁细胞，更换培养液，继续培养观察。破骨细胞2h后形态逐渐清晰，呈油煎蛋形、漏斗形或不规则形，细胞内有几个到十几个细胞核，胞浆内有时可见大小不等的空泡。酸性磷酸酶(ACP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)染色破骨细胞胞浆内酶活性部位呈红色，分有大小不等的空泡，核呈阴性。3化合物对成骨细胞的作用成骨细胞接种于孔板上，每个化合物配成一系列浓度(10-9-10-6mol/L)，连续观察10天，每两天检测一次，以MTT(噻唑兰)比色试验反应细胞增殖情况。在细胞分别培养至第12天、第18天、第24天，培养液中加入药物，两天后收集培养瓶的上清液进行检测。I型胶原的检测采用双抗夹心法，以对硝基苯酯二钠盐比色法检测碱性磷酸酶，用血清骨钙素放免药盒检测骨钙素。4化合物对破骨细胞的作用将分离获得的破骨细胞悬液加入预置骨片的孔板共同培养24h后，在培养液中加药物干扰，定时收集培养液，测培养液中抗酒石酸酸性磷酸酶活性和钙浓度。前者采用试剂盒测定，后者采用原子吸收法测定。实验结束时将含细胞骨片用戊二醛固定进行抗酒石酸酸性磷酸酶特异性染色，计阳性细胞数，综合判断化合物对破骨细胞抑制作用。下面提供实施例对本专利技术作进一步描述，但不对本专利技术有任何限制。实例化合物B2对成骨细胞和破骨细胞的作用B2在有效浓度范围内与对照组相比对成骨细胞有增殖作用，并明显促进骨钙素的分泌，对破骨细胞的抑制作用与阳性药物阿伦膦酸相当，具体结果如下表。表2 B2对成骨细胞的作用结果 表3 B2对破骨细胞的作用检测指标作用时间 对照阿伦膦酸 B2钙含量(mg/L) 0h124±3 122±3 124±624h 122±5 119±7 117±1248h 120±3 123±4 121±3.272h 174±8 184±26153±17.7TRACP活性(％) 24h 35.7±25.7 17.0±10.4*20.5±6.3*48h 24.8±9.0 11.9±10.2** 18.2±7.4*72h 22.8±6.1 10.4±6.8**12.5±6.4*细胞计数 7d354±169185±91* 216±77*注*P＜0.05，**P＜0.0权利要求1.一类具有如下结构的芳香含氮双膦酸衍生物 R1为一个或两个卤素、烷基、烷本文档来自技高网...
【技术保护点】
一类具有如下结构的芳香含氮双膦酸衍生物＊＊＊Ｒ↓［１］为一个或两个卤素、烷基、烷氧基、ＣＯＯＨ、ＮＨ↓［２］、ＮＯ↓［２］、４－ＮＨＣＨ（ＰＯ↓［３］（ＣＨ３）↓［２］）↓［２］、４－ＮＨＣＨ（ＰＯ↓［３］Ｈ↓［２］）↓［２］， Ｒ↓［２］为Ｈ或ＣＨ↓［３］。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢雨礼，谢毓元，陈文致，严雪铭，
申请(专利权)人：中国科学院上海药物研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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