一种籼稻川香29B成熟胚愈伤组织的遗传转化方法技术

一种籼稻川香29B成熟胚愈伤组织的遗传转化方法，其中包括愈伤诱导、继代和分化、遗传转化等过程，所诱导愈伤诱导率高、质量好，继代不易褐化，分化效率高，在其他四种生产上广泛应用的籼稻品种(9311、明恢63、中9B，Ⅱ-32B)中适用性也较好，再生率为60-80％之间，其遗传转化效率可高达26％以上。

Genetic transformation method for indica rice fragrant 29B mature embryo callus

Method for genetic transformation of Indica Rice Chuanxiang 29B callus of mature embryos, including callus induction, subculture and differentiation, genetic transformation process, induced callus induction rate is high, the quality is good, not easy to browning subculture, differentiation and high efficiency, is widely used in the other four kinds of production of rice varieties (9311 and Minghui 63, 9B, -32B II) application is also good, the regeneration rate is between 60-80%, the genetic transformation efficiency can reach more than 26%.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物组织培养和基因工程
涉及适用于三系籼型杂交水稻亲本川香29B成熟胚愈伤组织的农杆菌介导的遗传转化方法。
技术介绍
农杆菌介导的遗传转化体系由于操作简单、T-DNA插入到基因组的拷贝数低、可以转化大片段DNA等优点，已成为基因遗传转化的常规手段广泛应用于水稻基因功能研究和分子育种中。水稻的胚性愈伤组织是农杆菌遗传转化的良好受体，其组培特性的好坏将直接决定农杆菌介导水稻遗传转化能否成功。籼稻和粳稻是栽培稻的两个亚种，大多数粳稻品种组培特性较好，愈伤组织诱导容易、增殖速度快、耐继代培养能力强、分化再生率高。许多粳稻品种已经建立成熟的组培体系和遗传转化体系。而栽培面积广的大多数籼稻品种具有不良的组培特性，其表现为愈伤组织诱导率和再生率低，后续继代培养中容易褐化，使得籼稻遗传转化效率低，有的品种甚至难以进行转化，目前，虽然少数籼稻品种已经建立稳定的组织培养体系和转化体系，但由于不同品种籼稻之间组培特性差别较大，不能适用于大多数籼稻品种。高效、广泛适用的籼稻组织培养体系和转化体系尚未建立，特别是在生产上有广泛应用价值的籼稻品种存在组织培养困难、遗传转化效率低等问题，极大地阻碍了籼稻基因功能研究和基因的利用，因此，探索具有重要应用价值的某类或每种籼稻品种最适的培养基和方法，以及遗传转化方法具有重要理论和实践意义，川香29B是优质籼型香稻保持系，其母本为川香29A具有开花习性好，异交结实率高，抗病性强，米质优良且有香味等特点，利用川香29A已成功配制十多个杂交稻品种或组合。该品种具有许多优良农艺性状，也是水稻重要农艺性状相关基因和香味基因定位研究重要材料，我们系统地研究分析了培养基成分、激素、凝胶种类、碳源种类和浓度对生产上广泛应用的优质籼稻品种川香29B成熟胚愈伤组织培养的影响，探索出的适合于川香29B的植物组织培养基和方法，所获得的愈伤组织质量好、生长快、再生分化效率高(达90％)。在此基础上研究了农杆菌的浓度、乙酰丁酰酮的浓度等因素对遗传转化的影响，转化效率可提高到26％以上，获得了非常理想的结果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种籼稻川香29B成熟胚愈伤组织的遗传转化方法，其中包括愈伤诱导、继代和分化、遗传转化过程，所诱导愈伤诱导率高、质量好，继代不易褐化，分化效率高，在其他四种生产上广泛应用的籼稻品种(9311、明恢63、中9B，Ⅱ-32B)中适用性也较好，再生率为60-80％之间，遗传转化效率高，可达26％以上。本专利技术通过以下技术方案实现。本专利技术所述的一种籼稻川香29B成熟胚愈伤组织的遗传转化方法，包括以下步骤：1)筛选适合于籼稻川香29B成熟胚组织培养的基本成分，命名为NML培养基。大量元素：KNO3(2.83g/L)；KH2PO4(0.4g/L)；MgSO4·7H2O(0.185g/L)CaCl2(0.125g/L)；(NH4)2SO4(0.463g/L)。微量元素：KI(0.83mg/L)；H3BO3(6.2mg/L)；MnSO4·4H2O(22.3mg/L)；ZnSO4·7H2O(8.6mg/L)；Na2MoO4·2H2O(0.25mg/L)；CuSO4·5H2O(0.025mg/L)；CoCl2·6H2O(0.025mg/L)。铁盐：FeSO4·7H2O(27.8mg/L)；Na2-EDTA·2H2O(37.3mg/L)。有机成分：烟酸(1.0mg/L)；盐酸吡哆醇(VB6)(1.0mg/L)；盐酸硫胺素(VB1)(1.0mg/L)；Glycine(2.0mg/L)；肌醇(100mg/L)。2)愈伤组织诱导培养及诱导培养基。将籼稻成熟种子，去壳后，先用70-75％酒精浸泡1min，然后用0.1％HgCl2消毒6-8min；无菌水冲洗6次，然后将灭菌的籼稻成熟胚接入到愈伤组织诱导培养基中，在26-28℃，暗环境下培养一个月的时间，诱导愈伤组织。诱导培养基配方为：在NML培养基基本成分基础上，添加2,4-D3.0mg/L；L-proline0.5g/L；Glutamine0.5g/L；水解酪蛋白0.6g/L；蔗糖30g/L；Phytagel3.0-3.2g/L，pH5.9。3)愈伤组织继代培养及继代培养基。将诱导出来的愈伤组织，挑取淡黄色，颗粒或块状的愈伤组织，接种到继代培养基中，在26℃下暗环境培养，继代培养周期为15-20天。继代培养基配方：在NML培养基基本成分基础上，添加2,4-D3.0mg/L；L-proline0.5g/L；Glutamine0.5g/L；水解酪蛋白0.8g/L；麦芽糖30.0g/L；Phytagel3.0-3.2g/L，pH5.9。4)愈伤组织预培养及预培养基。将上述继代2次的淡黄色颗粒状愈伤组织，接种到预培养基中，在26-28℃暗培养3-5天，4天为宜。预培养基配方：1/2NML大量元素和微量元素，NML铁盐和有机成分，添加2,4-D3.0mg/L；水解酪蛋白0.6g/L；麦芽糖20.0g/L；葡萄糖10.0g/L；乙酰丁酰酮(AS)200μmol/L；琼脂7.0g/L，pH5.4-5.6。5)农杆菌浸染籼稻愈伤组织。将携带双元载体的农杆菌先在YEB固体培养基(添加相应抗生素，如壮观霉素、卡那霉素等)上划线培养，挑取单菌落在YEB液体培养基中培养2-3天，收集农杆菌，用农杆菌悬浮培养基悬浮农杆菌至OD600＝0.1-0.2之间，用此浓度农杆菌菌液浸染预培养后的愈伤组织，常温下浸染10-30min。农杆菌悬浮培养基配方：1/2NML大量元素和微量元素，NML铁盐和有机成分，添加2,4-D3.0mg/L；水解酪蛋白0.6g/L；麦芽糖20.0g/L；葡萄糖10.0g/L；乙酰丁酰酮(AS)200μmol/L，pH5.2。6)农杆菌和愈伤组织共培养。将浸染后的愈伤组织置于灭菌滤纸上，在超净工作台上开最大风力晾干60-90min，然后将愈伤组织接入到共培养基中，19-20℃暗环境下培养3天。共培养基配方：1/2NML大量元素和微量元素，NML铁盐和有机成分，添加2,4-D3.0mg/L；水解酪蛋白0.6g/L；麦芽糖20.0g/L；葡萄糖10.0g/L；乙酰丁酰酮(AS)200μmol/L；琼脂7.0g/L，pH5.4-5.6。7)抗性愈伤筛选。将共培养后的愈伤组织先用无菌水冲洗5-6次，最后一次用含400mg/L头孢霉素和250mg/L的羧苄本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种籼稻川香29B成熟胚愈伤组织的遗传转化方法，其特征是包括以下步骤：1)筛选适合于籼稻川香29B成熟胚组织培养的基本成分：大量元素：KNO3 2.83g/L；KH2PO4 0.4g/L；MgSO4·7H2O 0.185g/LCaCl2 0.125g/L；(NH4)2SO4 0.463g/L；微量元素：KI 0.83mg/L；H3BO3 6.2mg/L；MnSO4·4H2O 22.3mg/L；ZnSO4·7H2O 8.6mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L；CuSO4·5H2O 0.025mg/L；CoCl2·6H2O 0.025mg/L；铁盐：FeSO4·7H2O 27.8mg/L；Na2‑EDTA·2H2O 37.3mg/L；有机成分：烟酸1.0mg/L；盐酸吡哆醇1.0mg/L；盐酸硫胺素1.0mg/L；Glycine 2.0mg/L；肌醇100mg/L；2)愈伤组织诱导培养及诱导培养基：将籼稻成熟种子，去壳后，先用70‑75％酒精浸泡1min，然后用0.1％HgCl2消毒6‑8min；无菌水冲洗6次，然后将灭菌的籼稻成熟胚接入到愈伤组织诱导培养基中，在26‑28℃，暗环境下培养一个月的时间，诱导愈伤组织；诱导培养基配方为：在NML培养基基本成分基础上，添加2,4‑D 3.0mg/L；L‑proline 0.5g/L；Glutamine 0.5g/L；水解酪蛋白0.6g/L；蔗糖30g/L；Phytagel 3.0‑3.2g/L，pH 5.9；3)愈伤组织继代培养及继代培养基；将诱导出来的愈伤组织，挑取淡黄色，颗粒或块状的愈伤组织，接种到继代培养基中，在26℃下暗环境培养，继代培养周期为15‑20天；继代培养基配方：在NML培养基基本成分基础上，添加2,4‑D 3.0mg/L；L‑proline 0.5g/L；Glutamine 0.5g/L；水解酪蛋白0.8g/L；麦芽糖30.0g/L；Phytagel 3.0‑3.2g/L，pH 5.9；4)愈伤组织预培养及预培养基：将上述继代2次的淡黄色颗粒状愈伤组织，接种到预培养基中，在26‑28℃暗培养3‑5天；预培养基配方：1/2NML大量元素和微量元素，NML铁盐和有机成分，添加2,4‑D 3.0mg/L；水解酪蛋白0.6g/L；麦芽糖20.0g/L；葡萄糖10.0g/L；乙酰丁酰酮200μmol/L；琼脂7.0g/L，pH5.4‑5.6；5)农杆菌浸染籼稻愈伤组织：将携带双元载体的农杆菌先在YEB固体培养基添加壮观霉素或卡那霉素，上划线培养，挑取单菌落在YEB液体培养基中培养2‑3天，收集农杆菌，用农杆菌悬浮培养基悬浮农杆菌至OD600＝0.1‑0.2之间，用此浓度农杆菌菌液浸染预培养后的愈伤组织，常温下浸染10‑30min；农杆菌悬浮培养基配方：1/2NML大量元素和微量元素，NML铁盐和有机成分，添加2,4‑D 3.0mg/L；水解酪蛋白0.6g/L；麦芽糖20.0g/L；葡萄糖10.0g/L；乙酰丁酰酮200μmol/L，pH5.2；6)农杆菌和愈伤组织共培养：将浸染后的愈伤组织置于灭菌滤纸上，在超净工作台上开最大风力晾干60‑90min，然后将愈伤组织接入到共培养基中，19‑20℃暗环境下培养3天；共培养基配方：1/2NML大量元素和微量元素，NML铁盐和有机成分，添加2,4‑D 3.0mg/L；水解酪蛋白0.6g/L；麦芽糖20.0g/L；葡萄糖10.0g/L；乙酰丁酰酮200μmol/L；琼脂7.0g/L，pH5.4‑5.6；7)抗性愈伤筛选：将共培养后的愈伤组织先用无菌水冲洗5‑6次，最后一次用含400mg/L头孢霉素和250mg/L的羧苄青霉素浸泡10‑20min，然后将愈伤置于无菌滤纸上，在超净工作台上开最大风力晾干90‑120min，接入到筛选培养基中，筛选两次，第一次筛选培养基添加8g/L琼脂作为固化剂，培养条件为26‑28℃暗培养15‑20天；第二次筛选培养基添加3.2g/L的phytagel作为固化剂，培养条件为26‑28℃暗培养，直至长出新的愈伤组织；筛选培养基配方：在NML培养基基本成分基础上，添加2,4‑D 3.0mg/L；L‑proline 0.5g/L；Glutamine 0.5g/L；水解酪蛋白0.8g/L；麦芽糖30g/L；适量的载体上抗性标记的筛选试剂；头孢霉素400mg/L；羧苄青霉素250mg/L；琼脂8.0g/L或Phytagel 3.0‑3.2g/L，pH 5.9；8)抗性愈伤分化：将筛选出的抗性愈伤接种到分化培养基中进行植株再生，在26‑28℃下，全天24h光照培养，光照强度为2000‑3000Lux，一个月后分化出幼苗；分化培养基配方：NML培养基基础上，添加6‑BA 3.5mg/L；NAA 0.4mg...

【技术特征摘要】
1.一种籼稻川香29B成熟胚愈伤组织的遗传转化方法，其特征是包括以下步骤：
1)筛选适合于籼稻川香29B成熟胚组织培养的基本成分：
大量元素：KNO32.83g/L；KH2PO40.4g/L；MgSO4·7H2O0.185g/LCaCl20.125g/L；
(NH4)2SO40.463g/L；
微量元素：KI0.83mg/L；H3BO36.2mg/L；MnSO4·4H2O22.3mg/L；ZnSO4·7H2O8.6mg/
L；Na2MoO4·2H2O0.25mg/L；CuSO4·5H2O0.025mg/L；CoCl2·6H2O0.025mg/L；
铁盐：FeSO4·7H2O27.8mg/L；Na2-EDTA·2H2O37.3mg/L；
有机成分：烟酸1.0mg/L；盐酸吡哆醇1.0mg/L；盐酸硫胺素1.0mg/L；Glycine2.0mg/L；
肌醇100mg/L；
2)愈伤组织诱导培养及诱导培养基：
将籼稻成熟种子，去壳后，先用70-75％酒精浸泡1min，然后用0.1％HgCl2消毒6-8min；
无菌水冲洗6次，然后将灭菌的籼稻成熟胚接入到愈伤组织诱导培养基中，在26-28℃，暗环
境下培养一个月的时间，诱导愈伤组织；
诱导培养基配方为：在NML培养基基本成分基础上，添加2,4-D3.0mg/L；L-proline
0.5g/L；Glutamine0.5g/L；水解酪蛋白0.6g/L；蔗糖30g/L；Phytagel3.0-3.2g/L，pH
5.9；
3)愈伤组织继代培养及继代培养基；
将诱导出来的愈伤组织，挑取淡黄色，颗粒或块状的愈伤组织，接种到继代培养基中，
在26℃下暗环境培养，继代培养周期为15-20天；
继代培养基配方：在NML培养基基本成分基础上，添加2,4-D3.0mg/L；L-proline
0.5g/L；Glutamine0.5g/L；水解酪蛋白0.8g/L；麦芽糖30.0g/L；Phytagel3.0-3.2g/L，pH
5.9；
4)愈伤组织预培养及预培养基：
将上述继代2次的淡黄色颗粒状愈伤组织，接种到预培养基中，在26-28℃暗培养3-5
天；
预培养基配方：1/2NML大量元素和微量元素，NML铁盐和有机成分，添加2,4-D3.0mg/
L；水解酪蛋白0.6g/L；麦芽糖20.0g/L；葡萄糖10.0g/L；乙酰丁酰酮200μmol/L；琼脂7.0g/
L，pH5.4-5.6；
5)农杆菌浸染籼稻愈伤组织：
将携带双元载体的农杆菌先在YEB固体培养基添加壮观霉素或卡那霉素，上划线培养，
挑取单菌落在YEB液体培养基中培养2-3天，收集农杆菌，用农杆菌悬浮培养基悬浮农杆菌
至OD600＝0.1-0.2之间，用此浓度农杆菌菌液浸染预培养后的愈伤组织...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖鹏飞，李绍波，彭晓珏，阎新，朱友林，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36