一种紫色甘薯脱毒的方法技术

本发明专利技术涉及一种紫色甘薯脱毒的方法，其特征在于：该方法采用变温热处理及茎尖培养技术结合的方法实现，步骤包括：①、紫色甘薯试管苗快繁体系的建立，确保紫色甘薯茎尖分化培养中茎尖分生组织培养处于无菌状态；②、紫色甘薯茎尖分化培养，使病毒在植物根尖及芽尖含量不均匀，进行部分脱毒处理；③、确定变温热处理条件，紫色甘薯茎尖再生组织在(40±1)℃ 黑暗 16 h/d，（25±1)℃光照（2600 lx）8 h/d条件下恢复；④、利用酶联免疫吸附技术对紫色甘薯茎尖再生苗病毒的检测。该方法克服病毒对紫色甘薯的损伤及破坏，保证了机体内的各种生理生化代谢的正常运作，提高紫色甘薯的产量与品质，使紫色甘薯能够更广泛的应用于在食用、药用等方面。

Method for detoxification of purple sweet potato

The invention relates to a purple sweet potato detoxification method, characterized in that: the method adopts variable heat treatment and shoot tip culture method combined with the realization of the steps include: establish the purple sweet potato plantlets in vitro micropropagation system, ensure that the purple sweet potato stem apex meristem culture and differentiation culture in the sterile condition; purple sweet potato stem tip culture and differentiation, the virus in the plant roots and shoots was not uniform, part of detoxification treatment; 3, determine the varying heat treatment conditions, purple sweet potato stem tip tissue regeneration in (40 + 1) C 16 h/ D dark, (25 + 1) light (C 2600 LX) 8 h/d under the condition of recovery; II, using enzyme detection of purple sweet potato plantlets regenerated from shoot apex Virus ELISA technique. This method overcomes the virus of purple potato damage and destruction, to ensure the normal operation of various physiological and biochemical metabolism in the body, improve the yield and quality of purple sweet potato, the purple sweet potato can be more widely applied in food and medicine etc..

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及作物品种选育
，具体涉及一种紫色甘薯脱毒的方法，尤其涉及利用变温热处理及茎尖培养技术结合对紫色甘薯进行脱毒处理的方法。
技术介绍
甘薯[Ipomoea.batatas(L.)Lam.]，俗称地瓜、番薯等名，为旋花科(Convolvulaceae)甘薯属甘薯种的蔓生性根茎类一年或多生草本植物，品种种类繁多，种植地域广泛，是我国的主要粮食作物之一。紫色甘薯（IpomoeabatatasL.），英文名:Purplesweetpotato，是甘薯中一个具有独特遗传性状和经济价值的稀有品种，因肉质呈紫色而得名，于20世纪90年代从日本引入我国。紫色甘薯不同于普通甘薯，它不仅含有丰富的维生素、花色苷和硒等功能成分，更具有抗癌、抗菌、抗氧化、抗高血糖、抗突变体、增强记忆和改善肝功能等作用，是一种集药用、保健、食用为一体的天然食品。紫色甘薯因其高效的健康价值，便捷的来源途径和低廉的成本受到广大消费者及研究人员的追捧与关注，是拥有极强应用价值及开发前景的经济作物。近年来，国外对紫色甘薯的研究主要集中于天然可食用性安全色素花色苷的提取与分析，生理保健的医学功能，代谢工程生产及食品加工等方面；我国对紫色甘薯的研究、开发、利用仍处于基础阶段。甘薯病毒病对世界各甘薯产区危害严重，在南非、尼日利亚、美洲等地区，病毒病导致甘薯减产达50%以上，我国甘薯发病率十分严重。现阶段世界上已报道的甘薯病毒达二十余种，主要包括：甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）、甘薯潜隐病毒（SPLV）、甘薯脉花叶病毒（SPVMV）、甘薯轻斑驳病毒（SPMMV）、甘薯黄矮病毒（SPYDV）、甘薯花椰菜花叶病毒（SPCLV）、烟草花叶病毒（TMV）、烟草条纹病毒（TVS）、黄瓜花叶病毒（CMV）及尚未定名的C-2和C-4等。我国大陆已发现的主要病毒有SPFMV、SPLV、SPVMV、SPMMV、TMV等5种。紫色甘薯以薯块和茎蔓等营养器官进行无性繁殖，在引种、繁殖和生产过程中易造成甘薯病毒病的积累和蔓延，从而导致紫色甘薯产量降低、品质下降、种性退化等问题。甘薯病毒病是世界性的病害，目前尚无特别有效的化学防治方法。紫色甘薯在我国种质资源稀少，利用脱毒技术培育脱毒紫色甘薯，仍是防止或减少因病毒病感染造成损失的有效途径。茎尖分生组织培养是利用病毒在植物根尖和芽尖含量的不均匀性原理进行脱毒，脱毒的成败很大程度上取决于茎尖的大小。热处理脱毒技术操作简单、见效明显，高温条件下便可致植物病毒钝化，繁殖停滞，短时期内即可获得脱毒植株；但温度、持续时间和热处理方式是影响存活率和脱毒率的主要因素。茎尖培养和热处理两种脱毒方法虽然广泛应用于植物育种研究且各有利弊，但将变温热处理与茎尖分生组织培养有效的结合应用于紫色甘薯脱毒的研究还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种紫色甘薯脱毒的方法，该方法克服病毒对紫色甘薯的损伤及破坏，保证了机体内的各种生理生化代谢的正常运作，提高紫色甘薯的产量与品质，使紫色甘薯能够更广泛的应用于在食用、药用等方面。本专利技术的目的是按以下技术方案实现的：一种紫色甘薯脱毒的方法，该方法采用变温热处理及茎尖培养技术结合的方法实现的，步骤包括：①、紫色甘薯试管苗快繁体系的建立，②、紫色甘薯茎尖分化培养，③、确定变温热处理条件，紫色甘薯茎尖再生组织在(40±1)℃黑暗16h/d，（25±1)℃光照（2600lx）8h/d条件下恢复，④、酶联免疫吸附技术对紫色甘薯茎尖再生苗病毒的检测。步骤①所述紫色甘薯试管苗快繁体系的建立是：配制加入1.5mg/L6-BA、0.2mg/LIAA的紫色甘薯试管无菌苗茎段扩繁培养基，将紫色甘薯薯块洗洁精震荡浸泡10min，流水冲洗30min，75%酒精浸泡60s，2%NaClO消毒15min，获得紫色甘薯无菌外植体，切取外植体的一个茎段接种于MS抑菌培养基上，16h/d光照、光照强度2600lx、25±1℃条件下人工气候培养箱中培养，30d后获得紫色甘薯试管无菌苗，挑选茁壮的紫色甘薯试管无菌苗，在无菌超净工作台上剪去试管苗上较大的叶片、切取大小一致、带有腋芽的无根节间为茎段，分别接种于紫色甘薯试管无菌苗茎段扩繁培养基中，并放置于光周期：16h/d光照、8h/d黑暗，光照强度为2600lx的人工气候箱中培养，用于步骤②中紫色甘薯茎尖分化培养；步骤②所述目标紫色甘薯茎尖分化培养是：无菌条件下切取步骤①中紫色甘薯试管无菌苗茎段上长0.5cm左右的紫色甘薯试管苗顶芽，去掉肉眼可见的叶片，然后在实体显微镜的观察下剥取长约1mm的茎尖分生组织圆锥体，接种到茎尖诱导培养基上，每个培养皿接种3个茎尖，在人工气候箱中，对接种在培养基上的茎尖进行不同条件的变温热处理培养，处理时间为30d。培养7～10d时茎尖开始膨大、转绿，在基部逐渐形成绿色愈伤组织，30d左右时茎尖形成小芽点，转入正常环境内培养，90d时小量扩繁1次已发育完整的植株并编号，用于步骤③中变温热处理；步骤③所述确定变温热处理条件，将步骤②获得的茎尖组培苗，在变温条件为40±1℃黑暗16h/d，25±1℃光照2600lx8h/d条件下，紫色甘薯茎尖再生组织成活率最高，恢复最好，用于步骤④中酶联免疫吸附技术对紫色甘薯茎尖再生苗病毒的检测；步骤④所述的酶联免疫吸附技术对步骤③中获得的紫色甘薯茎尖再生苗进行甘薯病毒检测：制备样本组织液：选取待测紫色甘薯茎尖再生植株，分别用剪刀仔细剪取其嫩叶，精准称取重量0.2g，液氮研磨后加入装有1mlPBS缓冲液（0.1mol/L，pH7.4）的1.5mlEppendorf管中，混合均匀后，3000r/min离心20min；ELISA法病毒检测：利用甘薯羽状斑驳病（SPFMV）、甘薯潜隐病毒（SPLV）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒对待测样本进行检测，检测步骤严格按试剂盒说明书操作，反应终止15min内用680酶标仪在450nm波长处依序测量各孔吸光度（OD值）；上述变温热处理及茎尖培养技术结合的方法中：步骤②所述茎尖分化培养符合《中华人民共和国农业行业标准脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程》规定，应用茎尖组织培养技术获得的再生试管苗，经检测确认不带甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘薯潜隐病毒(SPLV)，才确认是脱毒苗，故通过病毒检测确认不具有SPFMV、SPLV的紫色甘薯茎尖再生苗即为脱毒苗。本专利技术具有以下积极的效果：1、为实现专利技术目的，本专利技术使用紫色甘薯作为实验材料、结合无菌条件下获得的长约1mm的茎尖分生组织，及最适变温条件为(40±1)℃黑暗16h/d，（25±1)℃光照（2600lx）8h/d的变温热处理技术，对紫色甘薯进行脱毒处理，获得脱毒紫色甘薯苗。2、本专利技术以紫色甘薯作为脱毒处理材料，提高了紫色甘薯的产量及品质，并为紫色甘薯脱毒研究奠定了物质资源的基础。3、本专利技术的方法操作简单可行，具有明显优势和突破性特点。传统的茎尖分生组织培养、热处理脱毒技术相比，脱毒效果明显、存活率高、操作简单可行。对于紫色甘薯脱毒研究奠定了物质资源的基础。附图说明图1是本专利技术紫色甘薯试管苗生长过程图。图2是本专利技术利用酶联免疫吸附技术对紫色甘薯茎尖再生苗的检测结果。具体实施方式下面结合实施案例对本专利技术作进一步说明：一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种紫色甘薯脱毒的方法，其特征在于：该方法采用变温热处理及茎尖培养技术结合的方法实现，步骤包括：①、紫色甘薯试管苗快繁体系的建立，确保紫色甘薯茎尖分化培养中茎尖分生组织培养处于无菌状态；②、紫色甘薯茎尖分化培养，使病毒在植物根尖及芽尖含量不均匀，进行部分脱毒处理；③、确定变温热处理条件，紫色甘薯茎尖再生组织在(40±1)℃ 黑暗 16 h/d，（25±1)℃光照（2600 lx）8 h/d条件下恢复；④、利用酶联免疫吸附技术对紫色甘薯茎尖再生苗病毒的检测。

【技术特征摘要】
1.一种紫色甘薯脱毒的方法，其特征在于：该方法采用变温热处理及茎尖培养技术结合的方法实现，步骤包括：①、紫色甘薯试管苗快繁体系的建立，确保紫色甘薯茎尖分化培养中茎尖分生组织培养处于无菌状态；②、紫色甘薯茎尖分化培养，使病毒在植物根尖及芽尖含量不均匀，进行部分脱毒处理；③、确定变温热处理条件，紫色甘薯茎尖再生组织在(40±1)℃黑暗16h/d，（25±1)℃光照（2600lx）8h/d条件下恢复；④、利用酶联免疫吸附技术对紫色甘薯茎尖再生苗病毒的检测。2.根据权利要求1所述的一种紫色甘薯脱毒的方法，其特征在于：步骤①所述紫色甘薯试管苗快繁体系的建立是：配制加入1.5mg/L6-BA、0.2mg/LIAA的紫色甘薯试管无菌苗茎段扩繁培养基，将紫色甘薯薯块洗洁精震荡浸泡10min，流水冲洗30min，75%酒精浸泡60s，2%NaClO消毒15min，获得紫色甘薯无菌外植体，切取外植体的一个茎段接种于MS抑菌培养基上，16h/d光照（光照强度2600lx）、(25±1)℃条件下人工气候培养箱中培养，30d后获得紫色甘薯试管无菌苗，挑选茁壮的紫色甘薯试管无菌苗，在无菌超净工作台上剪去试管苗上较大的叶片、切取大小一致、带有腋芽的无根节间为茎段，分别接种于6种扩繁培养基中，并放置于光周期：16h/d光照、8h/d黑暗，光照强度为2600lx的人工气候箱中培养；步骤②所述目标紫色甘薯茎尖分化培养的方法是：无菌条件下切取步骤①中紫色甘薯试管无菌苗茎段上长0.5cm左右的紫色甘薯试管苗顶芽，去掉肉眼可见的叶片，然后在实体显微镜的观察下剥取长约1mm的茎尖分生组织圆锥体，接种到茎尖诱导培养基上，每个培养皿接种3个茎尖，在人工气候箱中，对接种在培养基上的茎尖进行不同条件的变温热处理培养，处理时间为30d。培养7～10d时茎尖开始膨大、转绿，在基部逐渐形成绿色愈伤组织，30d左右时茎尖形成小芽点，转入正常环境内培养，90d时小量扩繁1次已发育完整的植株并编号；步骤③所述确定变温热处理条件是：步骤②获得的茎尖组培苗,在变温条件为(40±1)℃黑暗16h/d，（25±1)℃光照（2600lx）8h/d条件下，获得的紫色甘薯茎尖再生组织成活率最高，恢复最好；步骤④所述利用酶联免疫吸附技术对...

【专利技术属性】
技术研发人员：周晓馥，徐洪伟，赵晶，
申请(专利权)人：吉林师范大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22