一种百合种球综合性脱毒方法技术

本发明专利技术提供了一种百合种球综合性脱毒方法，具体通过以下步骤完成：A、外植体生长点的剥取，B、热处理脱毒，C、外植体清洗消毒，D、生长点采集诱导培养，E、脱毒培养，F、病毒检测。该发明专利技术克服了现有技术存在的不足，综合运用热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织脱毒的脱毒方法，解决了单独使用一种方法存在的不足，该方法能有效减少病毒交叉感染的机会，脱毒率高，成活率高，能有效缩短种球培养周期。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于在播种或种植前测试或处理种子的方法，具体涉及一种百合种球脱毒的方法。
技术介绍
东方百合是百合杂种类中花朵最大而又最美丽的一大类，能散发出怡人的香味，故又称之为香水百合，深受人们的喜爱，是世界上广泛栽培的一大类百合杂种系。百合主要靠扦插繁殖和分球繁殖等方式繁殖，但长期的无性繁殖使病毒在体内积累，引发各种病毒病，严重影响种球和切花的产品品质，近年来，随着我国百合引种数量和种植面积的迅速增加，以及不规范的种球自繁，病毒病开始在我国各百合种植区发生流行，病毒病一般发病率在40～60%，二代种球带毒率有的达到90%以上，严重地制约了我国百合产业的提质增效。目前，国内外有关百合的脱毒处理主要是单独采用热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织脱毒及相互间的组合脱毒，这些方法单独使用时效率低，脱毒效果差，其普遍采用较好的是茎尖培养脱毒法，其常规的步骤是；通过植物顶端分生组织切取0.2～0.3mm茎尖，诱导愈伤组织，然后从愈伤组织分化产生鳞茎芽，长成小植株得到脱毒苗。例如，专利号为200410079613.2的中国专利公开了一种“东方百合脱毒小籽球的瓶内生成方法”，是采用茎尖作为外植体，经灭菌，诱导培养后获得东方百合脱毒鳞茎；该脱毒组织培养法存在的问题是:切取很小的茎尖分生组织，在添加6-BAl.0～2.0mg／L和NAA0.2～0.6mg／L的MS基本培养基上培养20～26d，茎尖会同时形成愈伤组织和不定芽，但从愈伤组织分化的不定芽易发生遗传变异；且未对病毒进行进一步的检测和监控，难于了解脱毒情况。也有如专利号为200910091972.6的中国专利公开了“一种百合种球病毒的脱除方法”，是采用暗培养，对无性繁殖系的组培苗两次剥取茎尖进行消毒并脱毒，茎尖的脱毒方式为茎尖热处理结合化学药剂脱毒，变温处理种球球芯3～6周，温度范围为26～38℃，同时用病毒唑脱毒，浓度为6～7mg/ml，茎尖大小为0.4～1.2mm。该方法是对组培苗进行脱毒，组培苗需在无菌条件下获取，获取环境要求严格。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种综合运用热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织脱毒的百合种球综合性脱毒方法，该方法能有效减少病毒交叉感染的机会，脱毒率高，成活率高，能有效缩短种球培养周期。本专利技术通过以下技术方案实现：百合种球综合性脱毒方法，包括以下步骤：A、外植体生长点的剥取：选优质种球，用浓度为20～40%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟；将消过毒的泥炭用水拌湿，使其含水量为46～66%，备用；再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的泥炭中，每箱下种20～26个种球，浇定根水，然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面；按切花种植方法正常管理，保持泥炭46～66%的水分；在温度为21～23℃，湿度为70～80%，光照强度1600～2000Lx，光照时间8～12h/d的条件下，经过6～7天后，芽长到6～6cm时进行热处理脱毒。B、热处理脱毒：将温度控制在36～38℃之间，湿度为70～86%，光照强度1600Lx，光照时间8～12h/d的环境条件下，经过7～16天培养，芽长高并绽开成莲座状。C、外植体清洗消毒：①用清水冲洗后，剥去部分叶片，用中性肥皂水洗6分钟，用纱布包好，清水冲洗12小时；②用浓度为0.1%的升汞浸泡8分钟；③再用浓度为76%的酒精浸泡8～16秒；④吐温80无菌水浸泡2～3分钟；⑤再用无菌水洗6～7遍至无泡沫。D、生长点采集诱导培养：采集长度为0.3～0.6mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养，温度21～23℃，光照强度1600～3000Lx，光照时间8～12h/d，培养40～60天后,生长点膨大成直径2～3cm的叶丛。其中，诱导培养基为：1／2MS+BA2.6～6mg/L+NAA0.26mg/L+糖40g/l+琼脂6.6g/L。E、脱毒培养：将诱导出的叶丛切成0.6cm小块，接种于脱毒培养基中，脱毒培养基为：MS+NAA0.2mg/L+0.4%糖+活性炭0.6%+病毒唑6mg/L+琼脂6.0g/L，在温度为21～23℃，光照时间为8～12h/d，光照强度为2000～3000Lx的环境条件下，经过40～60天培养，形成带球的瓶苗。其中，病毒唑的添加方法如下：a.用无菌蒸馏水配制好浓度为0.2mg/ml的病毒唑母液。.将无菌注射器的针头换成直径小于0.2纳米的滤筛，用带滤筛的无菌注射器吸取病毒唑母液。c.将高温灭菌后的培养基：MS+NAA0.2mg/L+0.4%糖+活性炭0.6%+琼脂6.0g/L，冷至36～40℃时，吸取病毒唑母液，按6mg/L用量添加后摇匀，分装入无菌瓶中，待冷却凝固后用于药物脱毒接种。F、病毒检测：将瓶苗采用RT-PCR检测法检测，经检测确认无任何病虫害现象，并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒病毒，即为百合脱毒种苗。优选的，步骤A是用浓度为40%的多菌灵600倍溶液浸泡种球30分钟。步骤D是采集长度为0.3～0.4mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养。有益效果①本专利技术采用综合脱毒技术，即将热处理、抗病毒药剂和茎尖培养相结合的方法，有效解决了单独使用一种方法存在的不足，缩短了培养周期，减少病毒交叉感染，植株成活率高，脱毒率明显提高，百合脱毒率达到80%以上，脱毒率较只采用高温处理提高了26～70%。②本专利技术的脱毒方法，采用了36～38℃的高温，在该高温下病毒出现钝化，其复制明显减弱或不再繁殖，该期间生产的嫩梢带病毒较少，且该温度能保证植株的成活率。③本专利技术脱毒培养基内添加病毒唑的方法能使脱毒更彻底。④热处理后剥取0.3～0.6mm的茎尖生长点进行培养，此操作简单，易于操作，脱毒效果好。具体实施例实施例1:百合种球综合性脱毒方法，包括以下步骤：A、外植体生长点的剥取：选优质种球，用浓度为20%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟；将消过毒的泥炭用水拌湿，使其含水量为46%，备用；再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的泥炭中，每箱下种20个种球，浇定根水，然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面；按切花种植方法正常管理，保持泥炭46%的水分；在温度为21℃，湿度为70%，光照强度1600Lx，光照时间8h/d的条件下，经过6～7天后，芽长到6cm时进行热处理脱毒。B、热处理脱毒：将温度控制在36℃之间，湿度为70%，光照强度1600Lx，光照时间8h/d的环境条件下，经过7～16天培养，芽长高并绽开成莲座状。C、外植体清洗消毒：①用清水冲洗后，剥去部分叶片，用中性肥皂水洗6分钟，用纱布包好，清水冲洗12小时；②用浓度为0.1%的升汞浸泡8分钟；③再用浓度为76%的酒精浸泡8秒；④吐温80无菌水浸泡2分钟；⑤再用无菌水洗6遍至无泡沫。D、生长点采集诱导培养：采集长度为0.3mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养，温度21℃，光照强度1600Lx，光照时间8h/d，培养40～60天后,生长点膨大成直本文档来自技高网...

【技术保护点】
百合种球综合性脱毒方法，其特征在于，包括以下步骤 ：A、 外植体生长点的剥取：选优质种球，用浓度为 20 ～ 40% 的多菌灵600倍溶液浸泡 30分钟；将消过毒的泥炭用水拌湿，使其含水量为 46 ～ 66%，备用；再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的基质中，每箱下种 20 ～ 26 个种球，浇定根水，然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面；按切花种植方法正常管理，保持基质 46 ～ 66% 的水分；在温度为 21 ～ 23℃，湿度为 70 ～ 80%，光照强度 1600 ～ 2000Lx，光照时间 8 ～ 12h/d 的条件下，经过 6 ～ 7 天后，芽长到 6 ～ 6cm 时进行热处理脱毒 ；B、 热处理脱毒：将温度控制在 36 ～ 38℃之间，湿度为 70 ～ 86%，光照强度 1600Lx， 光照时间 8 ～ 12h/d 的环境条件下，经过 7 ～ 16 天培养，芽长高并绽开成莲座状 ；C、 外植体清洗消毒：①用清水冲洗后，剥去部分叶片，用中性肥皂水洗 6 分钟，用纱布包好， 清水冲洗 12 小时； ②用浓度为 0.1% 的升汞浸泡 8 分钟；③再用浓度为 76% 的酒精浸泡 8 ～ 16 秒；④ 吐温 80 无菌水浸泡 2 ～ 3 分钟；⑤再用无菌水洗 6 ～ 7 遍至无泡沫 ；D、 生长点采集诱导培养：采集长度为 0.3 ～ 0.6 mm 的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养，温度 21 ～ 23℃， 光照强度 1600 ～ 3000Lx， 光照时间 8 ～ 12h/d， 培养 40 ～ 60天后, 生长点膨大成直径 2 ～ 3cm 的叶丛，所述诱导培养基为：1 ／ 2MS+BA2.6 ～ 6mg/L+NAA0.26 mg/L+ 糖 40g/l+ 琼脂 6.6g/L ；E、 脱毒培养：将诱导出的叶丛切成 0.6cm 小块，接种于脱毒培养基中，脱毒培养基为：MS+ NAA0.2mg/L+ 0.4% 糖 + 活性炭 0.6%+ 病毒唑 6 mg/L+ 琼脂 6.0 g/L， 在温度为 21 ～23℃， 光照时间为 8 ～ 12h/d， 光照强度为 2000 ～ 3000Lx 的环境条件下， 经过 40 ～ 60 天培养，形成带球的瓶苗 ；F、病毒检测：将瓶苗采用 RT‑PCR 检测法检测，经检测确认无任何病虫害现象，并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒，即为百合脱毒种，步骤 A 是用浓度为 40%的多菌灵 600 倍溶液浸泡种球 30 分钟，步骤 D 是采集长度为0.3 ～ 0.4mm 的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养，步骤 D 是采集长度为0.3 ～ 0.4mm 的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养。...

【技术特征摘要】
1.百合种球综合性脱毒方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、外植体生长点的剥取：选优质种球，用浓度为20～40%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟；将消过毒的泥炭用水拌湿，使其含水量为46～66%，备用；再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的基质中，每箱下种20～26个种球，浇定根水，然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面；按切花种植方法正常管理，保持基质46～66%的水分；在温度为21～23℃，湿度为70～80%，光照强度1600～2000Lx，光照时间8～12h/d的条件下，经过6～7天后，芽长到6～6cm时进行热处理脱毒；
B、热处理脱毒：将温度控制在36～38℃之间，湿度为70～86%，光照强度1600Lx，光照时间8～12h/d的环境条件下，经过7～16天培养，芽长高并绽开成莲座状；
C、外植体清洗消毒：①用清水冲洗后，剥去部分叶片，用中性肥皂水洗6分钟，用纱布
包好，清水冲洗12小时；②用浓度为0.1%的升汞浸泡8分钟；③再用浓度为76%的酒精浸泡8～16秒；④吐温80无菌水浸泡2～3分钟；⑤再用无菌水洗6～7遍至无泡沫；
D、生长点采集诱导培养：采集长度为0.3～0.6mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养，温度21～23℃，光照强度1600～3000Lx，光照时间8～12h/d，培养40～60天后,生长点膨大成直径2～3cm的叶丛，所述诱导培养基为：1／2MS+BA2.6～6mg/L+NAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨长能，
申请(专利权)人：松桃宏发肉食品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：贵州;52