一种食用百合的花药培养脱毒方法技术

本发明专利技术提供了一种食用百合的花药培养脱毒方法，该脱毒方法详细步骤包括：（1）配制食用百合花药诱导培养基；（2）接种花药的选材；（3）花药消毒与接种；（4）花药诱导培养；（5）胚性愈伤分化与继代培养；（6）食用百合鳞茎的炼苗与移栽；（7）食用百合单倍体植株的剔除。本发明专利技术的食用百合的花药培养脱毒方法通过花药培养途径获得了食用百合花粉植株，进而剔除花培群体中的单倍体杂株获得食用百合二倍体植株，对脱毒植株进一步百合病毒检测发现，该脱毒方法几乎达到了100%的脱毒，生产实验进一步发现食用百合脱毒植株的产量和品质均有了极大的提升。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种通过花药培养途径高效脱除百合病毒的食用百合的花药培养脱毒方法。
技术介绍
百合是单子叶植物亚纲百合科百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）的所有种类的总称，根据用途可分为药用百合、食用百合和观赏用百合（观赏百合）。据《中华人民共和国药典》（2005年版一部）规定，百合科植物卷丹（Liliumlancifolium.Thunb.）、百合（LiliumbrowniiF.E.Browniivar.viridulumBaker.）、细叶百合（LiliumpumilumDC.）的干燥肉质鳞叶为药用百合。而我国食用百合的主要品种有甘肃兰州百合、湖南邵阳百合、江苏宜兴百合，以兰州百合品质最好，在生产栽培、花卉市场常见的观赏用百合则有3大品种群，分别是庸香百合杂种系、亚洲百合杂种系和东方百合杂种系。食用百合是野生百合经过多年的良种驯化、品种筛选、以及人工栽培后，可供食用的、安全无毒的食品。我国自古就有食用百合的习惯。宋代林洪在《山家清供》中提到百合食用方法“春秋仲月采百合根暴干，捣筛和面作汤饼，最益气血，又蒸熟可以佐酒”。明代《花疏》中记有“百合宜兴最多，人取其根馈客”。明代中叶编纂的《平凉县志》中记载“蔬则百合山药最佳”。《本草纲目》中有“百合新者，可蒸可煮，和肉更佳；干者做粉食，最宜人”。明代高濂在《饮馔服食》中收有百合面，即“用百合捣为粉，和面搜为饼，为面食亦可”。迄今，食用百合已成为我国经济价值较高的药食两用植物，具有较好地药用价值和保健功能。百合鳞片含有丰富的淀粉、蛋白质、脂肪、糖类、果胶质、维生素、胡萝卜素等，还含有钙、磷、锌、铁、硒等13种微量元素和18种氨基酸，具有润肺止咳、清心安神、养阴止血、补脾健胃、清热解毒等功效。据资料统计，百合包括栽培种和野生种全世界有100多种，产于我国的有39种，其中有10个品种可供食用；而目前栽培面积较大的品种主要有宜兴百合、龙牙百合、兰州百合、川百合四种。百合以有性方式（种子繁殖）和无性方式进行繁殖，商业上主要以扦插繁殖和分球繁殖等无性繁殖为主，长期的无性繁殖将会使体内逐渐积累大量病毒致使植物发生病毒病，并导致种性退化，食用百合也不例外。病毒病经常对百合生产造成严重危害，其中发生普遍、危害严重的病毒有4种，即百合无病症病毒（LSV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、百合X病毒（LVX）和郁金香顶裂病毒等4种病毒危害。近年来，随着百合引种数量的增加、种植面积的扩大以及不规范的种球自繁，病毒病已开始在我国各百合种植区发生流行，一般发病率为40%-50%，二代种球的带毒率在90%以上。病毒病对食用百合的危害表现主要有：植株严重矮化，脉明，花叶，畸形，坏死斑，鳞茎变小，产量下降，种质明显退化，开花少且小，有的甚至盲花，严重时整株枯死，严重制约了我国食用百合的产量和质量。如何减少和消除病毒病，生产优质无毒种苗，是食用百合种球商品化生产面临的一个重要问题。目前，百合病毒病已成为仅次于真菌病害的主要病害，由于病毒复制与植物代谢密切相关，而且有些病毒的抗逆性很强，一直没有有效的防治措施，因此，获得无病毒苗成为优质高产食用百合的关键。目前，生产上主要是通过热处理、组培茎尖脱毒和化学处理等方法进行脱毒。然而，目前的食用百合脱毒方法并不完善，各种脱毒方法均有其不足之处。热处理是利用病毒和植物对温度敏感性的差异不同，利用高温对植物进行处理，高温使病毒钝化，在植物体内很难繁殖，部分植物细胞耐高温加速细胞分裂和繁殖，从而获得无病毒的新生植物组织部分，再进一步繁殖得到无病毒苗，然而热处理不能脱除所有病毒，且影响百合存活率；茎尖培养脱毒是利用病毒在植物体内分布不均匀，在根尖和茎尖病毒含量很少或不含病毒，因此，采用茎尖离体培养的方法可以脱除病毒，其缺点是植物的存活率很低；化学处理法是将抗病毒药剂注射进植物体内或者加入培养基中，以达到除去病毒的目的，一般要与茎尖组织培养相结合应用，可一定程度的提高茎尖脱毒效率和存活率。花药离体培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花药内花粉粒的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株的一种技术，花药培养主要用途为培育单倍体植株，然而，由于小孢子基本不携带病毒，通过花药培养培育的植株几乎能达到完全脱毒的目的，因此，若将离体的食用百合花药培育成单倍体植株，进而选择食用百合的单倍体植株加倍的正常植株来育苗，可以较好的达到食用百合脱毒的目的。然而，现有的食用百合花药培养效率较低，远远达不到生产的要求，主要在于百合花药诱导效率过低。培养基是花药培养的物质基础，直接关系到培养物的生长与分化，培养基组分是影响花培效率的一个很重要的因素。培养基各组分的合适用量，以及它们之间一定的组合关系，可导致花培效率的大幅度提高。筛选和优化培养基组分，提高培养基的诱导率，是提高花药培养力的有效措施。通过大量食用百合花药培养的摸索和实践，我们进一步优化了基本培养基配方，并且不断尝试加入一些提高花药诱导力的添加物并组合其种类搭配及浓度，摸索出了一种高效率地诱导食用百合花药诱导培养的培养基配方，达到了通过食用百合花药培养进行脱毒的产业化应用效率。我们的研究结果对于食用百合的脱毒技术的进步具有较大的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的缺陷，提供了一种通过花药培养途径高效脱除百合病毒的食用百合的花药培养脱毒方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案解决的：一种食用百合的花药培养脱毒方法，其特征在于：该花药培养脱毒方法的详细步骤如下：（1）配制食用百合花药诱导培养基食用百合花药诱导培养基按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：大量元素：KNO32500～2700mg/L，NH4NO31600～1800mg/L，KH2PO4440～480mg/L，MgSO4?7H2O350～390mg/L，CaCl2?2H2O820～860mg/L；微量元素：MnSO4?4H2O20～25mg/L，ZnSO4?7H2O8.0～9.0mg/L，H3BO36.0～6.5mg/L，KI0.8～0.85mg/L，CuSO4?5H2O0.02～0.03mg/L，CoCl?6H2O0.02～0.03mg/L，NaMoO4?2H2O0.2～0.3mg/L；铁盐：Na2-EDTA?2H2O35～40mg/L，FeSO4?7H2O25～30mg/L；有机成分：肌醇90～110mg/L，维生素B10.09～0.11mg/L，维生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种食用百合的花药培养脱毒方法，其特征在于：该花药培养脱毒方法的详细步骤如下：（1）配制食用百合花药诱导培养基食用百合花药诱导培养基按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：大量元素：KNO3 2500～2700mg/L，NH4NO3 1600～1800mg/L，KH2PO4 440～480mg/L，MgSO4∙7H2O 350～390mg/L，CaCl2∙2H2O 820～860mg/L；微量元素：MnSO4∙4H2O 20～25mg/L，ZnSO4∙7H2O 8.0～9.0mg/L，H3BO3 6.0～6.5mg/L，KI 0.8～0.85mg/L，CuSO4∙5H2O 0.02～0.03mg/L，CoCl∙6H2O 0.02～0.03mg/L，NaMoO4∙2H2O 0.2～0.3mg/L；铁盐：Na2‑EDTA∙2H2O 35～40mg/L，FeSO4∙7H2O 25～30mg/L；有机成分：肌醇 90～110mg/L，维生素B1 0.09～0.11mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，烟酸 0.45～0.55mg/L，甘氨酸 1.8～2.2mg/L，丝氨酸 0.75～0.85mg/L；激素：2，4‑D 3.2～3.6mg/L，KT 2.0～2.4mg/L；凝固剂：植物凝胶 6.0～6.5g/L；活性添加剂：椰乳14～16g/L，甘露醇20～24g/L，水解蛋白 0.8～1.0g/L，活性炭 0.35～0.45g/L；碳源：蔗糖55～65g/L；将大量元素、微量元素、铁盐、有机成分和激素分别配制成一定浓度倍数的母液贮备，配制时，预先量出配制培养基总量一半体积的蒸馏水，分别加入一定体积或质量的大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、活性添加剂，定容，加热至60‑80℃，然后加入碳源、凝固剂和激素，搅拌至沸腾后，培养基完全融解，停止加热，调节pH为5.8‑6.0，然后将培养基分装于500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml～150ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固；（2）接种花药的选材在食用百合正常现蕾开花季节，上午取材，用冰壶带回实验室；（3）花药消毒与接种将花蕾用自来水冲洗10～20min，在超净工作台无菌条件下，先用75%酒精消毒2min，再用0.1%升汞+2‑3滴吐温‑80消毒15min，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中取出带有花丝的花药，接种到步骤（1）的诱导培养基上；（4）花药诱导培养将接种花药后的培养基进行花药诱导培养，50‑65d后诱导出花药胚性愈伤；（5）胚性愈伤分化与继代培养无菌条件下将诱导成功的胚性愈伤组织转接到分化培养基上，光照条件下分化培养25‑40天至小芽长至0.6cm以上，将高于0.6cm的小芽切下，转接入继代培养基上继代培养，2‑3个月后即可得到直径 0.8‑2.0cm 的百合小鳞茎；（6）食用百合鳞茎的炼苗与移栽将食用百合小鳞茎的三角瓶封口膜打开炼苗，7～10d后将小鳞茎从三角瓶中取出，清洗掉根部的培养基残留，移栽入温室内，定期喷施百合壮苗营养液来壮苗；（7）食用百合单倍体植株的剔除采用根尖压片法观察所得食用百合植株的倍性，剔除仅含12条染色体的百合单倍体植株。...

【技术特征摘要】
1.一种食用百合的花药培养脱毒方法，其特征在于：该花药培养脱毒方法的详细步骤
如下：
（1）配制食用百合花药诱导培养基
食用百合花药诱导培养基按每升蒸馏水中由以下物质配制而成：
大量元素：KNO32500～2700mg/L，NH4NO31600～1800mg/L，KH2PO4440～480mg/L，
MgSO4?7H2O350～390mg/L，CaCl2?2H2O820～860mg/L；
微量元素：MnSO4?4H2O20～25mg/L，ZnSO4?7H2O8.0～9.0mg/L，H3BO36.0～6.5mg/L，
KI0.8～0.85mg/L，CuSO4?5H2O0.02～0.03mg/L，CoCl?6H2O0.02～0.03mg/L，NaMoO4?2H2O
0.2～0.3mg/L；
铁盐：Na2-EDTA?2H2O35～40mg/L，FeSO4?7H2O25～30mg/L；
有机成分：肌醇90～110mg/L，维生素B10.09～0.11mg/L，维生素B60.45～0.55mg/
L，烟酸0.45～0.55mg/L，甘氨酸1.8～2.2mg/L，丝氨酸0.75～0.85mg/L；
激素：2，4-D3.2～3.6mg/L，KT2.0～2.4mg/L；
凝固剂：植物凝胶6.0～6.5g/L；
活性添加剂：椰乳14～16g/L，甘露醇20～24g/L，水解蛋白0.8～1.0g/L，活性炭0.35
～0.45g/L；
碳源：蔗糖55～65g/L；
将大量元素、微量元素、铁盐、有机成分和激素分别配制成一定浓度倍数的母液贮备，
配制时，预先量出配制培养基总量一半体积的蒸馏水，分别加入一定体积或质量的大量元
素、微量元素、铁盐、有机成分、活性添加剂，定容，加热至60-80℃，然后加入碳源、凝固剂和
激素，搅拌至沸腾后，培养基完全融解，停止加热，调节pH为5.8-6.0，然后将培养基分装于
500ml的三角瓶中，每瓶盛120ml～150ml的培养基，密封后置于温度为121℃、压力为15kPa
高压蒸汽条件下灭菌20min，自然冷却凝固；
（2）接种花药的选材
在食用百合正常现蕾开花季节，上午取材，用冰壶带回实验室；
（3）花药消毒与接种
将花蕾用自来水冲洗10～20min，在超净工作台无菌条件下，先用75%酒精消毒2min，再
用0.1%升汞+2-3滴吐温-80消毒15min，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中取出带有花丝的花
药，接种到步骤（1）的诱导培养基上；
（4）花药诱导培养
将接种花药后的培养基进行花药诱导培养，50-65d后诱导出花药胚性愈伤；
（5）胚性愈伤分化与继代培养
无菌条件下将诱导成功的胚性愈伤组织转接到分化培养基上，光照条件下分化培养
25-40天至小芽长至0.6cm以上，将高于0.6cm的小芽切下，转接入继代培养基上继代培养，
2-3个月后即可得到直径0.8-2.0cm的百合小鳞茎；
（6）食用百合鳞茎的炼苗与移栽
将食用百合小鳞茎的三角瓶封口膜打开炼苗，7～10d后将小鳞茎从三角瓶中取出，清
洗掉根部的培养基残留，移栽入温室内，定期喷施百合壮苗营养液来壮苗；
（7）食用百合单倍体植株的剔除
采用根尖压片法观察所得食用百合植株的倍性，剔除仅含12条染色体的百合单倍体植
株。
2.根据权利要求1所述的食用百合的花药培养脱毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：王纪芝，宋立胜，尹纪岩，
申请(专利权)人：江苏强农农业技术服务有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32