一种酥梨的种质资源保存方法技术

本发明专利技术公开了一种酥梨的种质资源保存方法，该方法的技术流程包括：1）酥梨外植体的取材与消毒；2）不定芽诱导培养；3）种质慢生长保存；4）种质恢复生长；5）生根培养；6）炼苗移栽。本发明专利技术通过对酥梨组培条件的有效调控，并采用两种不同的种质保存培养基交替继代，有效减缓了保存材料的生长繁殖，降低了继代次数，极大延长了保存时间；采用本发明专利技术长期保存的种质经过复壮环节可以在较短的时间内恢复活力，移栽成活率高达95%以上，并且没有发生遗传变异，有效保持了酥梨种质的优良性状，为酥梨的良种繁育提供了有力的保障。

A Preservation Method for Germplasm Resources of Crispy Pear

The invention discloses a method for preserving the germplasm resources of crisp pear. The technological process of the method includes: 1) taking and disinfecting the explants of crisp pear; 2) adventitious bud induction culture; 3) slow growth preservation of germplasm; 4) germplasm resumption growth; 5) rooting culture; 6) seedling transplantation. The invention effectively slows down the growth and reproduction of preserved materials, reduces the number of subcultures and greatly prolongs the preservation time by effectively regulating the tissue culture conditions of crisp pear and adopting two different preservation media for succession. The long-term preserved germplasm of the invention can recover vitality in a relatively short period of time after rejuvenation, and the survival rate of transplantation is over 95%. No genetic variation occurred, which effectively maintained the good quality of Suli pear germplasm, and provided a strong guarantee for the breeding of Suli pear.

【技术实现步骤摘要】
一种酥梨的种质资源保存方法
本专利技术涉及一种酥梨的种质资源保存方法，具体涉及一种酥梨的组培繁殖种质保存和保存后种质恢复生长的方法，属于果林科学

技术介绍
梨是蔷薇科苹果亚科梨属植物(Pyrus)的总称，为乔木落叶果树，全世界约有30种，是主要的温带果树，其果实也是世界五大水果之一。梨是我国栽培的重要果树之一，栽培历史己有2500多年。我国的梨树栽培面积和产量多年来一直均居世界首位，是世界梨生产第一大国。梨果不仅鲜脆多汁、酸甜可口，而且营养丰富。梨果富含糖类、蛋白质、脂肪、钙、磷、铁、膳食纤维以及多种维生素，能满足人体多种营养需求。梨还有药用价值，具有降火、清心、润肺、化痰、止咳、退热、解疮毒和酒毒的功效，还可助消化、利尿、润肠通便、降低血压、预防感冒，常食用对健康十分有益。酥梨是梨的一种栽培品种，其果实近圆柱形，顶部平截稍宽，平均单果重250克；果皮表面光洁，新鲜为绿黄色，贮后黄色；果肉洁白，中粗，酥脆，汁多味浓甜，有石细胞；丰产性好，适应性广，对土壤气候条件要求不严，耐瘠薄，抗寒、抗病虫能力中等。酥梨原产于安徽省砀山县，是最古老的地方梨品种。砀山酥梨是我国传统三大名梨之首，以其果大汁多味甜且具有润肺止咳作用而驰名中外，是我国对外出口的主要品种。砀山酥梨还是我国重要的梨栽培种质资源之一，是我国梨育种的骨干亲本，在育种中发挥着重要作用。很多育种家通过杂交育种、芽变选种等手段，获得了以‘砀山酥梨’为亲本的杂交新品种、‘砀山酥梨’芽变品种，以及提纯复壮的‘砀山酥梨’优系，丰富了我国梨品种资源。但是近年来，由于酥梨产业发展速度过快，但缺乏一定的技术指导，砀山酥梨在全国盲目地推广开来，一些产地的环境不适合酥梨品种的要求，再加上生产管理不规范，导致酥梨原有种质退化，表现为果实外观比较差，果皮粗糙、果实石细胞含量较高，口感差，严重影响了其鲜果品质和市场价值。另一方面，酥梨通常采用嫁接、扦插、压条等无性繁殖方式进行生产，这些方法都可能携带一种甚至多种病毒或类病毒，在长期的繁殖过程中，病毒逐代积累，也会造成酥梨的种质退化。因此，开展酥梨的优良种质资源保存工作已成为当务之急，也是一项十分重要的基础工作。目前，我国梨种质资源的保存主要以资源圃的形式进行保存，即集中定植梨的种质资源到适合其生长的、有一定生态代表性的圃地，以长久保存。然而，这种保存方法存在着一些缺点，首先是种质圃保存有局限性如易受自然灾害(包括病虫害)的侵袭；其次是占地广，需要耗费大量的人力、物力和财力；第三是繁殖系数不高，无法进行大规模扩繁。因此，开展梨的离体保存工作具有重要的意义。离体保存按照保存的技术手段可分为常规继代保存、缓慢生长保存以及超低温保存。其中缓慢生长保存是通过改变培养物生长的外界环境条件，使细胞生长降至最小限度，但不死亡，从而达到延长继代培养时间的目的，与常规继代保存相比，具有继代次数少、遗传变异系数低、保存时间长的优点；与超低温保存相比，具有技术设备要求低、操作方便、价格廉价的优点，因此是本专利技术团队研究的重点方向。
技术实现思路
本专利技术针对目前酥梨种质资源的保存方面存在的缺陷或不足，目的在于使其外植体取材方便、继代周期加长、保存时间延长、保存成本降低、种质恢复生长效果好，能较好地稳定品种种性，满足科学开发利用酥梨种质资源的需要。本专利技术的目的是通过以下技术方案解决的：一种酥梨的种质资源保存方法，其特征在于，该方法的技术流程包括以下步骤：1）酥梨外植体的取材与消毒采集酥梨树当年生带芽且生长健壮无病虫的幼嫩枝条，小心摘除叶片，然后将枝条用洗衣粉水刷洗干净，切成1-2cm的茎段，每段含有1个顶芽或腋芽，再将茎段用流水冲洗20-30min，之后在超净工作台上用70%酒精消毒1min，无菌蒸馏水冲洗2-3次，再用0.6%的邻苯二甲醛消毒8-10min，期间需要不断地摇动使茎段充分接触溶液，无菌蒸馏水冲洗3次；用滤纸吸干表面水分后备用；2）不定芽诱导培养将上述消过毒的茎段接种于不定芽诱导培养基中，置于温度23-27℃、光照强度1800-2200lx、每天光照12-14h的条件下，培养27-35d诱导出不定芽；3）种质慢生长保存将诱导产生的高约1.5-2.0cm的不定芽从瓶中取出，切去基部褐化部分，转接到种质保存培养基①或种质保存培养基②上，用封口膜封闭瓶口，然后置于温度4-6℃、光照强度700-900Lx、每天光照10-12h的培养条件下缓慢生长，每12个月继代一次，种质保存培养基①和种质保存培养基②继代时交替使用，然后继续进行慢生长保存；4）种质恢复生长酥梨种质保存期结束后，将步骤3）中缓慢生长的不定芽转接到复壮培养基中，置于温度23-27℃、光照强度1500-2000lx、每天光照12-14h的条件下恢复生长，培养15-25d可获得生长健壮的酥梨不定芽；5）生根培养将上述不定芽切成单个，转接到生根培养基中，置于温度23-27℃、光照强度2000-2500lx、每天光照13-15h的条件下培养25-30天获得生根的组培苗；6）炼苗移栽当组培苗根系长至4-6条，根长3-5cm时，将组培苗移至大棚中利用自然光照进行炼苗，不打开瓶盖炼苗7d，打开瓶盖炼苗5d；将组培苗从瓶内移出，洗净附着在根部的培养基，将根部在5.5%高锰酸钾溶液中浸泡20min后，移栽入基质中，进行常规栽培管理。所述步骤1）中采集酥梨树枝条的时间为春季酥梨的盛花期。所述步骤2）中不定芽诱导培养基的配方为：1/2MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.8mg/LZT+0.2%活性炭+甲基磺酸乙酯0.4g/L，pH值为5.8~6.0。所述步骤3）中种质保存培养基①的配方为：KNO3198~224mg/L，NH4NO3815~835mg/L，KH2PO485~90mg/L，MgSO4·7H2O174~180mg/L，CaCl2·2H2O207~211mg/L，MnSO4·4H2O20~23mg/L，ZnSO4·7H2O7~9mg/L，H3BO311~14mg/L，KI0.6~0.7mg/L，CuSO4·5H2O0.022~0.026mg/L，CoCl2·6H2O0.022~0.026mg/L，Na2MoO4·2H2O0.20~0.30mg/L，FeSO4·7H2O27~28mg/L，Na2-EDTA35~36mg/L，肌醇50~60mg/L，谷胱甘肽21~25mg/L，脯氨酸4~8mg/L，维生素B10.3~0.6mg/L，维生素B60.4~0.7mg/L，烟酸0.4~0.6mg/L，核黄素0.4~0.6mg/L，二硫基丙醇5.6~6.2mg/L，氟节胺0.7~0.9mg/L，蔗糖27~32g/L，山梨醇29~33g/L，海藻酸钠2.5~3.0mg/L，葡萄籽粉2.3~2.9g/L，代森铵14~18mg/L，卡拉胶6~7g/L，pH为5.6~6.0。所述步骤3）中种质保存培养基②的配方为：KNO3915~931mg/L，NH4NO3815~835mg/L，KH2PO418~24mg/L，MgSO4·7H2O174~180mg/L，CaCl2·2H2O207~211mg/L，MnSO4·4H2O20~23mg/L，ZnSO4·7H2O7~9mg/L，H3BO31本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酥梨的种质资源保存方法，其特征在于，该方法的技术流程包括以下步骤：1）酥梨外植体的取材与消毒采集酥梨树当年生带芽且生长健壮无病虫的幼嫩枝条，小心摘除叶片，然后将枝条用洗衣粉水刷洗干净，切成 1‑2 cm的茎段，每段含有 1个顶芽或腋芽，再将茎段用流水冲洗 20‑30 min，之后在超净工作台上用70%酒精消毒1min，无菌蒸馏水冲洗 2‑3次，再用0.6%的邻苯二甲醛消毒8‑10min，期间需要不断地摇动使茎段充分接触溶液，无菌蒸馏水冲洗3次；用滤纸吸干表面水分后备用；2）不定芽诱导培养将上述消过毒的茎段接种于不定芽诱导培养基中，置于温度23‑27℃、光照强度1800‑2200lx、每天光照12‑14h的条件下，培养27‑35d诱导出不定芽；3）种质慢生长保存将诱导产生的高约1.5‑2.0cm的不定芽从瓶中取出，切去基部褐化部分，转接到种质保存培养基①或种质保存培养基②上，用封口膜封闭瓶口，然后置于温度4‑6℃、光照强度700‑900Lx、每天光照10‑12h的培养条件下缓慢生长，每12个月继代一次，种质保存培养基①和种质保存培养基②继代时交替使用，然后继续进行慢生长保存；4）种质恢复生长酥梨种质保存期结束后，将步骤3）中缓慢生长的不定芽转接到复壮培养基中，置于温度23‑27℃、光照强度1500‑2000lx、每天光照12‑14h的条件下恢复生长，培养15‑25d可获得生长健壮的酥梨不定芽；5）生根培养将上述不定芽切成单个，转接到生根培养基中，置于温度23‑27℃、光照强度2000‑2500lx、每天光照13‑15h的条件下培养25‑30天获得生根的组培苗；6）炼苗移栽当组培苗根系长至4‑6条，根长3‑5cm时，将组培苗移至大棚中利用自然光照进行炼苗，不打开瓶盖炼苗7d，打开瓶盖炼苗5d；将组培苗从瓶内移出，洗净附着在根部的培养基，将根部在5.5%高锰酸钾溶液中浸泡20min后，移栽入基质中，进行常规栽培管理。...

【技术特征摘要】
1.一种酥梨的种质资源保存方法，其特征在于，该方法的技术流程包括以下步骤：1）酥梨外植体的取材与消毒采集酥梨树当年生带芽且生长健壮无病虫的幼嫩枝条，小心摘除叶片，然后将枝条用洗衣粉水刷洗干净，切成1-2cm的茎段，每段含有1个顶芽或腋芽，再将茎段用流水冲洗20-30min，之后在超净工作台上用70%酒精消毒1min，无菌蒸馏水冲洗2-3次，再用0.6%的邻苯二甲醛消毒8-10min，期间需要不断地摇动使茎段充分接触溶液，无菌蒸馏水冲洗3次；用滤纸吸干表面水分后备用；2）不定芽诱导培养将上述消过毒的茎段接种于不定芽诱导培养基中，置于温度23-27℃、光照强度1800-2200lx、每天光照12-14h的条件下，培养27-35d诱导出不定芽；3）种质慢生长保存将诱导产生的高约1.5-2.0cm的不定芽从瓶中取出，切去基部褐化部分，转接到种质保存培养基①或种质保存培养基②上，用封口膜封闭瓶口，然后置于温度4-6℃、光照强度700-900Lx、每天光照10-12h的培养条件下缓慢生长，每12个月继代一次，种质保存培养基①和种质保存培养基②继代时交替使用，然后继续进行慢生长保存；4）种质恢复生长酥梨种质保存期结束后，将步骤3）中缓慢生长的不定芽转接到复壮培养基中，置于温度23-27℃、光照强度1500-2000lx、每天光照12-14h的条件下恢复生长，培养15-25d可获得生长健壮的酥梨不定芽；5）生根培养将上述不定芽切成单个，转接到生根培养基中，置于温度23-27℃、光照强度2000-2500lx、每天光照13-15h的条件下培养25-30天获得生根的组培苗；6）炼苗移栽当组培苗根系长至4-6条，根长3-5cm时，将组培苗移至大棚中利用自然光照进行炼苗，不打开瓶盖炼苗7d，打开瓶盖炼苗5d；将组培苗从瓶内移出，洗净附着在根部的培养基，将根部在5.5%高锰酸钾溶液中浸泡20min后，移栽入基质中，进行常规栽培管理。2.根据权利要求1所述的一种酥梨的种质资源保存方法，其特征在于，所述步骤1）中采集酥梨树枝条的时间为春季酥梨的盛花期。3.根据权利要求1所述的一种酥梨的种质资源保存方法，其特征在于，所述步骤2）中不定芽诱导培养基的配方为：1/2MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.8mg/LZT+0.2%活性炭+甲基磺酸乙酯0.4g/L，pH值为5.8~6.0。4.根据权利要求1所述的一种酥梨的种质资源保存方法，其特征在于，所述步骤3）中种质保存培养基①的配方为：KNO3198~224mg/L，NH4NO3815~835mg/L，KH2PO485~90mg/L，MgSO4·7H2O174~180mg/L，CaCl2·2H2O207~211mg/L，MnSO4·4H2O20~23mg/L，ZnSO4·7H2O7~9m...

【专利技术属性】
技术研发人员：关耀恒，高天龙，刘洋，
申请(专利权)人：江苏强农农业技术服务有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32