本发明专利技术涉及真核表达工业化酶的领域，具体的说是采用毕赤酵母制备糖基化的5-羟甲基糠醛氧化酶(HMFO)的方法。根据毕赤酵母密码子偏爱性优化HMFO基因序列，将优化的序列连接pPICZa-A载体，转化毕赤酵母X-33。筛选含有高拷贝HMFO基因的毕赤酵母，实现HMFO在毕赤酵母的高效分泌表达。同时表达的蛋白纯度高，纯化步骤简单。同时，该蛋白经过饭以后的糖基化修饰，活性高于已有的报道。该工艺能耗小，效率高，生产过程简单、绿色。本发明专利技术所述的专利具有很好的工业应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程法制备工业化酶领域，具体的说是采用毕赤酵母高效分泌表达糖基化修饰的HMFO。
技术介绍
HMFO是一种能能使羟甲基糠醛(HMF)转化成2,5呋喃二甲酸(FDCA)的生物酶。但目前该酶主要在大肠杆菌内表达，面临两个问题：表达量非常低，每升的发酵液产生的5-羟甲基糠醛氧化酶低于100mg，同时容易形成没有活性的包涵体。(参考文献Dijkman,W.P.,andFraaije,M.W.(2014).DiscoveryandCharacterizationofa5-HydroxymethylfurfuralOxidasefromMethylovorussp.StrainMP688.Appliedandenvironmentalmicrobiology80,1082-1090.)。如果该蛋白修饰后，如翻译后的糖基化可以提高它的稳定性和活性，而毕赤酵母属于真核生物能实现蛋白表达后的糖基化修饰。为了克服上述存在的问题，我们考虑用毕赤酵母表达该酶。所用的质粒具有甲醇氧化酶强效启动子，外源基因表达量高，摇瓶发酵可达到每升0.5克的水平；毕赤酵母培养、转化、高密度发酵等操作适合大规模化生产；分泌表达，杂蛋白污染少，便于产物纯化；以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。本专利技术首次实现HMFO在毕赤酵母进行优化表达，提高表达量。同时在HMFO基因前加有信号肽序列，该序列可以引导HMFO在细胞外分泌表达，减少了细胞内蛋白的污染。另外，毕赤酵母很少分泌其它蛋白。因而相对现有技术，本申请提高了酶的活性，而且提高了酶的纯度，减少了后期纯化成本，适用于工业化生产，具有显著的进步。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新构建的毕赤酵母高效表达糖基化修饰的羟甲基糠醛氧化酶，毕赤酵母含有高拷贝5-羟甲基糠醛氧化酶基因，该酶是分泌表达，有糖基化修饰。为了实现上述目标，本专利技术采用的技术方案为：根据毕赤酵母密码子偏爱性优化HMFO基因序列；筛选含有高拷贝HMFO基因的毕赤酵母；利用信号肽实现毕赤酵母对HMFO的分泌表达。一种新构建的毕赤酵母高效表达糖基化修饰的羟甲基糠醛氧化酶，毕赤酵母含有高拷贝5-羟甲基糠醛氧化酶基因，该酶是分泌表达，有糖基化修饰。所述的羟甲基糠醛氧化酶的氨基酸序列具有序列表SEQIDNO：2中氨基酸序列。(1)序列特征：序列类型：氨基酸；链型：单链；拓扑结构：线性(2)分子类型：蛋白质(3)假设：否(4)反义：否所述的羟甲基糠醛氧化酶的编码基因序列具有序列表SEQIDNO：1中核苷酸序列。(1)序列特征：基因组序列：碱基对；类型：核苷酸；链型：双链；拓扑结构：线性(2)分子类型：DNA(3)假设：否(4)反义：否根据质谱分系，该酶具有糖基化修饰位点，糖基化位点分别是第20位的丝氨酸，第161位的苏氨酸和第249位的丝氨酸。大肠杆菌表达的蛋白不能实现翻译后的修饰，不能完成这些位点的糖基化修饰。毕赤酵母属于真核生物，可以实现蛋白翻译后的修饰。根据质谱分析，其糖基化修饰的糖链长度为3-8个甘露糖。所述的5-羟甲基糠醛氧化酶制备方法如下：将羟甲基糠醛氧化酶的基因接到pICZa-A载体上，将该质粒线性化后，转入毕赤酵母。用1mg/ml的伯莱霉素筛选毕赤酵母阳性克隆转化子，得到含有高拷贝HMFO基因的毕赤酵母，用甲醇诱导表达72-144h；同时取发酵液离心,收集上清即为HMFO蛋白液。所含有的5-羟甲基糠醛氧化酶基因的拷贝数在10以上。本专利技术具有如下优点：1.本专利技术所述的技术方案采用毕赤酵母高效分泌表达5-羟甲基糠醛氧化酶，避免了毒素的产生，安全可靠。2.本专利技术所述的技术方案是高拷贝筛选，提高了5-羟甲基糠醛氧化酶的产量。3.本专利技术所述的技术方案是分泌表达5-羟甲基糠醛氧化酶，提高了酶的纯度，简化或避免了后续的纯化操作，大大简化了生产工艺。4.新构建的毕赤酵母能分泌表达糖基化修饰的5-羟甲基糠醛，提高了酶的活性。文献报道，2mM5-羟甲基糠醛(5-HMF)的底物加入5uM的HMFO,实现HMF转化成8％的FDCA(Dijkman,W.P.,andFraaije,M.W.(2014).DiscoveryandCharacterizationofa5-HydroxymethylfurfuralOxidasefromMethylovorussp.StrainMP688.Appliedandenvironmentalmicrobiology80,1082-1090).我们在同样的条件下，用2uM的HMFO,实现HMF转化成10％的FDCA，是报道的酶的活性2倍。序列表SEQIDNO：1(HMFO基因序列)序列表SEQIDNO：2(HMFO蛋白质序列)具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明：实施例11.将5-羟甲基糠醛氧化酶基因(序列见序列表SEQIDNO：1)，经NadeI和XhoI双酶切后(基因在pUC18质粒上，质粒进行双酶切，质粒36ul，NdeI和XhoI各3ul，加10x的Hbuffer5ul。酶切反应条件，37℃，3h)。然后用1％的琼脂糖电泳回收酶切的基因片段(使用片段回收试剂盒，Axygen公司，货号AP-GX-50)。纯化的片段连接到同样条件双酶切的PET28a载体上，经T4连接酶在16℃连接过夜(反应体系中各物质组成：8ul质粒，1ul反应缓冲，1ulT4连接酶)。转化本实验室冻存的大肠杆菌Top10感受态。取连接液5ul加入到100ul的感受态细胞中，冰上混合10分钟，放到42℃水浴45秒，冰上放置2分钟。加入400ulLB培养基，37℃，150rpm培养40分钟，涂布在有50ug/ml卡那霉素LB平板上，在37℃培养过夜。构建的质粒PET28a-HMFO在大肠杆菌菌体内扩增。2.用质粒试剂盒(Axygen公司，型号05114kai)纯化质粒。取1ul质粒，加入到100ul的感受态细胞大肠杆菌BL21(DE3)中，冰上混合10分钟，放到42℃水浴45秒，冰上放置2分钟。加入400ulLB培养基，37℃，150rpm培养40分钟，铺含有50ug/ml卡那霉素LB平板，在37℃培养过夜，用卡那霉素LB平板筛选阳性克隆。3.挑选上述培养出来的单菌落，接种含有卡那霉素的大肠杆菌BL21菌株于5mLLB液体培养基中(含50ug/mL卡纳霉素)，37℃震荡培养过夜。按1：100的比例稀释过夜菌，一般转接1mL过夜培养物于100mL(含50ug/mL卡纳霉素)LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600＝0.6(大约3h)。加入IPTG至终浓度0.5mmol/l，30℃继续培养10个小时，经SDS-PAGE分析，HMFO形成包涵体，没有活性。4.用北京碧云天的BCA试剂盒测蛋白(货号P0006)，大肠杆菌表达HMFO量极低，每升发酵液，目标蛋白的产量低于100mg。实施例2基因密码子的优化主要考虑以下因素：1.毕赤酵母对外源基因的表达也和基因密码子的选用密切相连。毕赤酵母在密码子使用上的偏爱性对从翻译HMFO基因表达的规律有重要意义。毕赤酵母密码子偏爱性,通过分析Pichiapastoris的30种蛋白编码基因的同义密码子使用情况并计算该酵母的密码子用法,确定Pi本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种糖基化的5‑羟甲基糠醛氧化酶，其特征在于：所述的5‑羟甲基糠醛氧化酶的氨基酸序列具有序列表SEQ ID NO：2中氨基酸序列；糖基化位点分别是第20位的丝氨酸，第161位的苏氨酸和第249位的丝氨酸。
【技术特征摘要】
1.一种糖基化的5-羟甲基糠醛氧化酶，其特征在于：所述的5-羟甲基糠醛氧化酶的氨基酸序列具有序列表SEQIDNO：2中氨基酸序列；糖基化位点分别是第20位的丝氨酸，第161位的苏氨酸和第249位的丝氨酸。2.根据权利要求1所述的5-羟甲基糠醛氧化酶，其特征在于：所述的羟甲基糠醛氧化酶的编码基因序列具有序列表SEQIDNO：1中核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的5-羟甲基糠醛氧化酶，其特征在于：根据质谱分系，该酶具有糖基化修饰位点，糖基化位点分别是第20位的丝氨酸，第161位的苏氨酸和第249位的丝氨酸；根据质谱分析，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：尹恒，谭海东，刘启顺，吴树丽，王文霞，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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