本发明专利技术公开了一种罗格列酮抑制大鼠肝星状细胞活化的研究方法，分别采用RT‑PCR法检测PDGF mRNA的表达以及采用Western blot方法检测MEK1/2、ERK1/2的蛋白表达情况。通过本发明专利技术证实脂联素具有抑制肝纤维化的作用，其机制与PPARγ的转录与调控有关，通过提高PPARγ与脂联素的表达，从而减少I型胶原、MMP2的表达，提高TIMP2的表达，减少细胞外基质的生成及正常内皮下基质的降解，达到阻断肝纤维化进展的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物细胞研究领域，具体是一种罗格列酮抑制大鼠肝星状细胞活化的研究方法。
技术介绍
最近研究发现PPARγ的表达参与HSC静态表型的维持，在肝星状细胞的活化调控中发挥重要作用，与肝纤维化的形成有非常密切的关系。采用慢病毒载体介导转染法研究PPARγ对鼠肝纤维化模型的作用机制发现，在体外实验中PPARγ能够抑制活化的HSC表达α-SMA、Ⅰ型胶原，抑制HSC的增殖；在体内实验中也发现PPARγ基因转染组羟脯氨酸、PPARγ及α-SMA、I型胶原蛋白水平与肝纤维化组对比有显著差异。Lee等在研究从狭叶柴胡中提取的一种木酚素(Kaerophyllin)对硫代乙酰胺引起的大鼠肝损伤和纤维化形成的阻断作用机制中发现，其抗炎、抑制HSC活化的作用与上调PPAR-γ表达有关。噻唑烷二酮类药物(thiazolidinediones，TZDs)是临床上抗糖尿病药，常用包括罗格列酮、环格列酮、吡格列酮，该类药物是体内PPARγ高选择性、强效激动剂，能够激活PPARγ从而改善机体糖脂代谢。近期有研究提示PPARγ配体罗格列酮能够通过抑制HSC增殖，使细胞周期静止,促进HSC凋亡从而逆转甲硫氨酸胆碱缺乏饮食诱导的小鼠纤维性脂肪肝。Lee等报道PPARγ配体环格列酮对HSC增殖的抑制效应与逆转ERK活性有关，并且能够抑制由瘦素或血小板衍生因子引起的HSC增殖。赵彩彦等研究提示环格列酮的抗肝纤维化的活性可能与它对TGFβ1-TGFβR1信号抑制和阻断Smad3依赖性的PAI-1和胶原表达有关。Nan等通过研究罗格列酮对缓解营养性纤维性脂肪肝的形态学和分子生物学依据中发现罗格列酮减轻肝纤维化通过激活PPAR-γ，而PPAR-γ能抑制HSC活化，抑制TGFβ、CTGF表达。RamaniK等在研究肝星状细胞蛋氨酸腺苷转移酶2A(MAT2A)转录调控的分子机制中发现罗格列酮处理的HSC引起的MAT2A表达能降低PPARγ表达，PPARγ是静止的HSCMAT2A的负调控因子。肝纤维化是肝脏对各种急慢性损伤的修复反应，而肝星状细胞的活化是肝纤维化过程的核心环节，罗格列酮作为核转录因子PPARγ的激动剂，对于肝星状细胞的抑制已得到证实。HSC细胞的激活和表型变化并非单独孤立由某个细胞因子引起，而是涉及到众多细胞因子、不同信号通路的协同作用，其中研究热点的是MAPK途径，而研究表明其中ERK1/2在HSC增殖和胶原蛋白的异常表达中发挥着重要作用。本专利技术选取研究最广泛的PDGF作为肝星状细胞的刺激因素，选取最经典的ERK1/2通路为研究对象，用Westemblot检测罗格列酮处理后肝星状细胞ERK1/2蛋白磷酸化的表达情况，进一步揭示其抑制肝星状细胞I、Ⅲ型胶原mRNA表达的信号通路调节机制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种罗格列酮抑制大鼠肝星状细胞活化的研究方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种罗格列酮抑制大鼠肝星状细胞活化的研究方法，步骤如下：(1)采用RT-PCR法检测PDGFmRNA的表达11)样品处理：收获HSC-T6细胞，移入离心管中，加入Trizol，混匀，室温静置4～6min；加入氯仿，振荡12～18s，静置23min，4℃下离心，12000g×15min，取上清，加入异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置8～12min；4℃下离心，12000g×10min，弃上清；加入体积分数为75％的乙醇，轻轻洗涤沉淀；4℃下离心，7500g×5min，弃上清；晾干，加入55℃的DEPC水溶解10～15min；12)扩增PCR：反应体系为50μL，5×buffer10μL，0.5μL的20μmol/L的α-SMA引物，TAKARAExTaqHS酶0.25μL，用水补至40μL加入第一步反应后液体10μL；用PCR仪扩增，PCR反应条件：PPARγ及β-actin为：94℃5min，94℃预变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min；Adiponectin为：94℃5min，94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸5min；13)PDGF表达半定量分析：将PCR反应产物分别在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，得到PPARγmRNA及AdiponectinmRNA的扩增产物，用凝胶成像系统对条带进行光密度扫描，以PDGF/β-actin的比值为PDGFmRNA的相对表达水平，实验重复5次；其中，设置β-actin为参照；(2)采用Westernblot方法检测MEK1/2、ERK1/2的蛋白表达情况21)细胞中总蛋白的提取a)溶解Western及IP细胞裂解液，混匀，在使用前加入PMSF，使PMSF的最终浓度为0.9～1.1mM；b)对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍，按照6孔板每孔加入100～200μL裂解液的比例加入裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，裂解液接触细胞1～2s后，细胞就会被裂解；c)充分裂解后，以10000～14000转/min的转速离心3～5min，取上清；22)Westernblot方法操作a)聚丙烯酰胺凝胶的配制，根据MEK1/2、ERK1/2蛋白分子的大小，配置相应浓度的分离胶和积层胶；b)样品处理：将样品加入等量的4×SDS上样缓冲液，100℃加热3～5min，离心12000g×1min，每组取等量的总蛋白上样，10％SDS-PAGE分离蛋白质；c)加样：依次加入待分析样品，每孔15～25μL；d)电泳：加样完毕，选择50～70V的电压进行电泳3.5～4.5h，直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳；e)转膜：蛋白质经SDS-PAGE分离后，从凝胶中转移到固相支持物上PVDF膜，电泳槽加满预冷电转印液，插入电转印夹，4℃，100V，200mA，2h；f)膜的封闭：漂洗转印膜，室温，3次×15min，以尽量洗去转印膜上的SDS，放入质量分数为5％脱脂奶封闭液内，摇床震动，室温封闭1h；g)抗体杂交：(1)封闭后pvdf膜放入杂交袋中，加入适当稀释的一抗，4℃孵育过夜1xTBS-T，pH7.6洗液洗膜3次×10min；(2)过氧化物酶标记山羊大鼠二抗孵育4h，1xTBS-T洗膜3次×15min；h)显色、显影、定影：ECM显色剂后曝光，将曝光后的X感光胶片放入显影液中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止，再放入定影液中定影，胶片长期保存；用Umax2100XL扫描仪以及凝胶分析软件Bandscan5.0分析目标带的分子量和灰度值，以MEK1/2、ERK1/2与对应的内参β-actin蛋白灰度值相比，计算二者灰度比值。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤(1)中，HSC-T6细胞的培养，(a)细胞复苏：从液氮中取出冻存管，迅速放入36-37℃水中，不时摇动，使其急速融化，30～60s内完成，冻存管用70％酒精擦拭消毒，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，缓慢滴加等量培养液，以500～1000r/min的转速离心4～6min，去上清后再用培养液洗一次，用培养液适当稀释后，装入培养瓶37℃，5％CO2浓度的培养箱内培养，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种罗格列酮抑制大鼠肝星状细胞活化的研究方法，其特征在于，步骤如下：(1)采用RT‑PCR法检测PDGF mRNA的表达11)样品处理：收获HSC‑T6细胞，移入离心管中，加入Trizol，混匀，室温静置4～6min；加入氯仿，振荡12～18s，静置23min，4℃下离心，12000g×15min，取上清，加入异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置8～12min；4℃下离心，12000g×10min，弃上清；加入体积分数为75％的乙醇，轻轻洗涤沉淀；4℃下离心，7500g×5min，弃上清；晾干，加入55℃的DEPC水溶解10～15min；12)扩增PCR：反应体系为50μL，5×buffer10μL，0.5μL的20μmol/L的α‑SMA引物，TAKARA Ex Taq HS酶0.25μL，用水补至40μL加入第一步反应后液体10μL；用PCR仪扩增，PCR反应条件：PPARγ及β‑actin为：94℃5min，94℃预变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min；Adiponectin为：94℃5min，94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸5min；13)PDGF表达半定量分析：将PCR反应产物分别在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，得到PPARγmRNA及Adiponectin mRNA的扩增产物，用凝胶成像系统对条带进行光密度扫描，以PDGF/β‑actin的比值为PDGFmRNA的相对表达水平，实验重复5次；其中，设置β‑actin为参照；(2)采用Western blot方法检测MEK1/2、ERK1/2的蛋白表达情况21)细胞中总蛋白的提取a)溶解Western及IP细胞裂解液，混匀，在使用前加入PMSF，使PMSF的最终浓度为0.9～1.1mM；b)对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍，按照6孔板每孔加入100～200μL裂解液的比例加入裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，裂解液接触细胞1～2s后，细胞就会被裂解；c)充分裂解后，以10000～14000转/min的转速离心3～5min，取上清；22)Western blot方法操作a)聚丙烯酰胺凝胶的配制，根据MEK1/2、ERK1/2蛋白分子的大小，配置相应浓度的分离胶和积层胶；b)样品处理：将样品加入等量的4×SDS上样缓冲液，100℃加热3～5min，离心12000g×1min，每组取等量的总蛋白上样，10％SDS‑PAGE分离蛋白质；c)加样：依次加入待分析样品，每孔15～25μL；d)电泳：加样完毕，选择50～70V的电压进行电泳3.5～4.5h，直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳；e)转膜：蛋白质经SDS‑PAGE分离后，从凝胶中转移到固相支持物上PVDF膜，电泳槽加满预冷电转印液，插入电转印夹，4℃，100V，200mA，2h；f)膜的封闭：漂洗转印膜，室温，3次×15min，以尽量洗去转印膜上的SDS，放入质量分数为5％脱脂奶封闭液内，摇床震动，室温封闭1h；g)抗体杂交：(1)封闭后pvdf膜放入杂交袋中，加入适当稀释的一抗，4℃孵育过夜1xTBS‑T，pH7.6洗液洗膜3次×10min；(2)过氧化物酶标记山羊大鼠二抗孵育4h，1xTBS‑T洗膜3次×15min；h)显色、显影、定影：ECM显色剂后曝光，将曝光后的X感光胶片放入显影液中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止，再放入定影液中定影，胶片长期保存；用Umax2100XL扫描仪以及凝胶分析软件Bandscan5.0分析目标带的分子量和灰度值，以MEK1/2、ERK1/2与对应的内参β‑actin蛋白灰度值相比，计算二者灰度比值。...
【技术特征摘要】
1.一种罗格列酮抑制大鼠肝星状细胞活化的研究方法，其特征在于，步骤如下：(1)采用RT-PCR法检测PDGFmRNA的表达11)样品处理：收获HSC-T6细胞，移入离心管中，加入Trizol，混匀，室温静置4～6min；加入氯仿，振荡12～18s，静置23min，4℃下离心，12000g×15min，取上清，加入异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置8～12min；4℃下离心，12000g×10min，弃上清；加入体积分数为75％的乙醇，轻轻洗涤沉淀；4℃下离心，7500g×5min，弃上清；晾干，加入55℃的DEPC水溶解10～15min；12)扩增PCR：反应体系为50μL，5×buffer10μL，0.5μL的20μmol/L的α-SMA引物，TAKARAExTaqHS酶0.25μL，用水补至40μL加入第一步反应后液体10μL；用PCR仪扩增，PCR反应条件：PPARγ及β-actin为：94℃5min，94℃预变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min；Adiponectin为：94℃5min，94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸5min；13)PDGF表达半定量分析：将PCR反应产物分别在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，得到PPARγmRNA及AdiponectinmRNA的扩增产物，用凝胶成像系统对条带进行光密度扫描，以PDGF/β-actin的比值为PDGFmRNA的相对表达水平，实验重复5次；其中，设置β-actin为参照；(2)采用Westernblot方法检测MEK1/2、ERK1/2的蛋白表达情况21)细胞中总蛋白的提取a)溶解Western及IP细胞裂解液，混匀，在使用前加入PMSF，使PMSF的最终浓度为0.9～1.1mM；b)对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍，按照6孔板每孔加入100～200μL裂解液的比例加入裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，裂解液接触细胞1～2s后，细胞就会被裂解；c)充分裂解后，以10000～14000转/min的转速离心3～5min，取上清；22)Westernblot方法操作a)聚丙烯酰胺凝胶的配制，根据MEK1/2、ERK1/2蛋白分子的大小，配置相应浓度的分离胶和积层胶；b)样品处理：将样品加入等量的4×SDS上样缓冲液，100℃加热3～5min，离心12000g×1min，每组取等量的总蛋白上样，1...
【专利技术属性】
技术研发人员：应杰，李传生，张卫东，
申请(专利权)人：盱眙县人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。