一种脱氧核糖寡核苷酸及其制备方法技术

一种式(1)所示的脱氧核糖寡核苷酸及其液相合成方法。本发明专利技术提供的液相合成制备脱氧核糖寡核苷酸的方法，包括了一种脱氧核糖寡核苷酸保护基组合方法，通过用β‑氰乙基直接保护脱氧核糖寡核苷酸的3’磷酸基团，并在脱去β‑氰乙基后能够直接参与下一轮的合成，合成反应在反应瓶或反应釜中进行，不受固相载体或合成仪的限制，可实现大规模制备脱氧核糖寡核苷酸。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种脱氧核糖寡核苷酸及其制备方法。
技术介绍
化学合成脱氧核糖寡核苷酸是指通过促使核苷酸单体间形成5’-3’磷酸二酯键，从而将多个核苷酸单元连接为脱氧核糖寡核苷酸链的过程，其中涉及保护的核苷酸的合成。目前通用的脱氧核糖寡核苷酸合成方法采用的是固相合成法，首先将核苷酸上的5’-OH用二对甲氧三苯甲基(DMT)保护，碱基上的氨基用苯甲酰基保护，3’-OH用氨基亚磷酸化合物进行活化。将第一个核苷酸的3’-OH与固相树脂结合在一起，并脱去5’-OH上的保护基，使裸露的5’-OH与第二个核苷酸的用氨基亚磷酸化合物进行活化的3’-OH之间形成一个亚磷酸三酯，亚磷酸三酯经碘氧化形成磷酸三酯，再加入三氯乙酸除去第二个核苷酸的5’-OH上的保护基。至此，脱氧核糖寡核苷酸链已经延伸了一个核苷酸单元，并可投入下一轮延伸反应。经过若干轮的延伸反应，整个脱氧核糖寡核苷酸片段合成完毕之后，用浓氢氧化铵将脱氧核糖寡核苷酸片段从固相树脂上洗脱下来，经过脱保护和纯化得到脱氧核糖寡核苷酸。上述固相合成法的优点在于：1)自动化，合成反应全部由合成仪自动完成；2)合成周期短；3)产率高，单步的缩合反应一般产率大于98％。但是固相合成法也存在一些缺点：1)合成规模小，目前较大规模的固相合成规模一般不超过100微摩尔，远远满足不了用于药物原料的要求；2)难于达到高纯度，由于合成方法的限制，得到的脱氧核糖寡核苷酸不可避免的含有碱基数N-1，N-2等非目标的脱氧核糖寡核苷酸片段，这对于药物应用是十分不利的；3)浪费严重，为充分反应，每个合成循环中，往往需加入数倍于反应实际消耗量的亚磷酰胺单体以达到过量，且循环结束后需使用大量有机溶剂作为冲洗溶剂，洗去未反应的亚磷酰胺单体，4)成本高，反应所需的固相载体和亚磷酰胺单体价格昂贵，使合成的脱氧核糖寡核苷酸成本高昂。因为脱氧核糖寡核苷酸在生命活动中的重要功能和目前核酸研究技术的高速发展，大规模脱氧核糖寡核苷酸的合成意义十分重大。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服目前的脱氧核糖寡核苷酸合成方法的合成规模小、成本高等缺点，提供一种能够大规模合成脱氧核糖寡核苷酸的方法。本专利技术提供了一种式(1)所示的脱氧核糖寡核苷酸：其中，R为氢或R1，R1表示三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二对甲氧三苯甲基或三甲氧基三苯甲基；n为1-100的整数；B表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的B相同或不同；R3表示卤素原子、硝基或甲氧基。其中，所述酰基可以为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基；卤素原子可以为氯或溴。本专利技术提供的式(1)的化合物中，当R为H时，式(1)与如下所述的x大于等于1时的式(2)等价；当R为R1时，式(1)与如下所述的式(4)等价。本专利技术还提供了一种液相合成脱氧核糖寡核苷酸的方法，其特征在于，该方法包括在缩合剂存在下，在缩合反应条件下，使式(2)的化合物与式(3)的化合物在第一液态反应介质中接触，得到式(4)的化合物；其中，x为0-50的整数；y为1-50的整数；B1和B2各自表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的B1或B2相同或不同；R1和R3的定义如式(1)中所述；A+表示三烷基铵离子或二烷基铵离子。本专利技术提供的方法得到的脱去保护基的脱氧核糖寡核苷酸，可以具有生物活性，可以用于各种脱氧核糖寡核苷酸的用途，例如RNA干扰。本专利技术提供的液相合成制备脱氧核糖寡核苷酸的方法，包括了一种脱氧核糖寡核苷酸保护基组合方法，通过用β-氰乙基直接保护脱氧核糖寡核苷酸的3’磷酸基团，而不使用固相载体，使得式(4)化合物在脱去β-氰乙基后能够直接参与下一轮的合成，且合成产物与固相合成法脱保护程序一致，纯度更高。本专利技术由于在液相中进行反应，不需要使用固相载体，又由于底物不需数倍过量，节省了原料，降低了成本。本专利技术采用保护的脱氧核糖寡核苷酸盐作为原料，合成反应在反应瓶或反应釜中进行，不受固相载体或合成仪的限制，可实现大规模制备脱氧核糖寡核苷酸。附图说明图1为实施例1得到的脱保护的二十一聚体核糖核酸的质谱分析图。图2为实施例1得到的脱保护的二十一聚体核糖核酸与同序列的固相合成法产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图。具体实施方式本专利技术提供了一种式(1)所示的脱氧核糖寡核苷酸。在式(1)中：R为氢或R1，R1表示保护基团，可以为各种能够保护5’-羟基的基团，优选为三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二对甲氧三苯甲基或三甲氧基三苯甲基；n理论上可以为任意正整数，优选为1-100的整数，更优选为1-50的整数，更进一步优选为1-30的整数；B表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，各重复单元中的B可以相同或不同；R3表示苯环上的取代基，优选为卤素原子、硝基或甲氧基，且各个重复单元中的R3可以相同或不同，其中R3在苯环上的位置没有限制，可以为邻位、间位或对位。其中n＝1时，上述式(1)表示的是核苷酸，n为大于1的整数时，上述式(1)表示的是脱氧核糖寡核苷酸。在式(1)中，作为保护基的各个所述酰基可以相同或不同，各自可以为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基。式(1)中，所述的卤素原子可以为氟、氯、溴或碘，优选为氯或溴，更优选为氯。本专利技术提供的式(1)的化合物中，当R为H时，式(1)与如下所述的x大于等于1时的式(2)等价；当R为R1时，式(1)与如下所述的式(4)等价，而且，当R为R1时，式(1)与如下所述的式(6)等价。本专利技术还提供了一种液相合成脱氧核糖寡核苷酸的方法，其特征在于，该方法包括在缩合剂存在下，在缩合反应条件下，使式(2)的化合物与式(3)的化合物在第一液态反应介质中接触，得到式(4)的化合物。在式(2)、(3)或(4)中，x理论上可以为任意非负整数，优选为0-50的整数，更优选为0-25的整数，更进一步优选为0-15的整数；y理论上可以为任意正整数，优选为1-50的整数，更优选为1-25的整数，更进一步优选为1-15的整数；B1和B2各自表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的B1或B2可以相同或不同；所述酰基的定义如式(1)中所述；R1、R2和R3的定义如式(1)中所述；A+表示三烷基铵离子或二烷基铵离子；所述的三烷基铵离子或二烷基铵离子中的各个烷基可以相同或不同，可以各自具有1-6个碳原子，优选具有1-4个碳原子。所述缩合反应所使用的缩合剂以及缩合反应的条件是本领域普通技术人员熟知的，本专利技术对其没有特别的限制，例如，可以使用1-均三甲苯磺酰三唑、1-均三甲苯磺酰(3-硝基)-三唑、1-均三甲苯磺酰四唑、1-均三异丙基苯磺酰三唑、1-均三异丙基甲苯磺酰(3-硝基)-三唑和1-均三异丙基磺酰四唑中的一种或多种作为缩合剂；可以使用吡啶、二氯甲烷、乙腈、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种作为所述第一液态反应介质；所述缩合反应条件可以包括：相对于1摩尔的式(3)的化合物，在x等于0时，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种式(1)所示的脱氧核糖寡核苷酸：其中，R为氢或R1，R1表示三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二对甲氧三苯甲基或三甲氧基三苯甲基；n为1‑100的整数；B表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的B相同或不同；R3表示卤素原子、硝基或甲氧基。

【技术特征摘要】
2015.08.17 CN 20151050429461.一种式(1)所示的脱氧核糖寡核苷酸：其中，R为氢或R1，R1表示三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二对甲氧三苯甲基或三甲氧基三苯甲基；n为1-100的整数；B表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的B相同或不同；R3表示卤素原子、硝基或甲氧基。2.根据权利要求1所述的脱氧核糖寡核苷酸，其中，所述酰基为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基；所述卤素原子为氯或溴。3.一种液相合成脱氧核糖寡核苷酸的方法，其特征在于，该方法包括在缩合剂存在下，在缩合反应条件下，使式(2)的化合物与式(3)的化合物在第一液态反应介质中接触进行缩合反应，得到式(4)的化合物；其中，R1表示三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二对甲氧三苯甲基或三甲氧基三苯甲基；x为0-50的整数；y为1-50的整数；B1和B2各自表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的B1或B2相同或不同；R3的定义与权利要求1相同；A+表示三烷基铵离子或二烷基铵离子。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述酰基为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基；所述的三烷基铵离子或二烷基铵离子中的各个烷基相同或不同，并且各自具有1-6个碳原子。5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述缩合剂为1-均三甲苯磺酰三唑、1-均三甲苯磺酰(3-硝基)-三唑、1-均三甲苯磺酰四唑、1-均三异丙...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鸿雁，
申请(专利权)人：苏州瑞博生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32