本发明专利技术涉及一种荧光生物传感器的制备方法及其应用，基于聚胸腺嘧啶单链(poly T)的DNA可以成为制备发荧光的铜纳米粒子(Cu NPs)的模板的事实，发现一种新型的“糖果”(CS)构型的DNA结构，相较于传统的poly T为模板的制备Cu NPs，增强了Cu NPs的荧光信号，提高的发光效率。基于此现象，设计了一种新型的无标记的荧光恢复的生物传感器，该传感器利用了外切酶(exo III)和金属离子切割的双循环自动放大手段，特异性的检测特殊序列的DNA。该传感器具有很好的灵敏度，而且具有高的选择性，价格低廉和操作简单的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及荧光传感器制备
，具体涉及荧光生物传感器，其制备方法及其用途。
技术介绍
在过去的几十年，生物分子模板的荧光无机金属纳米颗粒具有获得了大量的关注，在这些生物大分子中，DNA因其独特的纳米结构，优良的可编程特性，包括杂环氮原子的丰富功能基团，氨基组和磷酸基团，它可以与特定的金属离子结合，并提供金属纳米粒子的成核位点，成为了最佳的候选者。在过去的十年中，DNA为模板不同的荧光金属纳米颗粒已经得到了深入的关注，如金纳米粒子和银纳米粒子。最近几年，一种新的荧光纳米材料–DNA模板的铜纳米粒子类(DNA-CuNPs)作为荧光光探针，因其具有良好的生物相容性、成本低，易于制备，毒性低，优异的荧光性能等优点，已经逐渐的应用在构建荧光生物传感上。聚胸腺嘧啶单链(polyT)为模板的制备发荧光的CuNPs最早由王课题组最早发现。随后利用polyT为模板的作为发荧光的CuNPs探针，运用在生物传感器上检测各种不同的生物物质不断被报道。与此同时增强CuNPs的荧光效率成为关注的课题。尽管不久前，卢的小组设计了一种由多聚T环和一个随机的双链序列DNA序列为茎新型发夹DNA结构，作为CuNPs形成的模板，以此来提高其荧光效率。但是我们仍然不知道什么状态下的聚T构象可以直接影响CuNPs的荧光信号。因此，基于聚T单链DNA模板，设计可控和高效的荧光CuNPs仍然是一个挑战。
技术实现思路
针对以上现有技术问题，本专利技术的目的在于提供一种基于polyT为基础的新型的“糖果”(CS)构型的DNA结构，可以增强CuNPs的荧光效率，并运用此构造设计了一种无标记的荧光恢复的生物传感器用于检测特殊序列的DNA片段(目标DNA)。根据不同浓度的目标DNA，构建线性关系，实现了对目标DNA基因灵敏性、特异性的检测。具体技术方案如下：荧光生物传感器的制备方法，包括如下步骤：(1)DNA用缓冲溶液稀释到并储存；(2)发夹DNA包括HP1,HP2,HP3和HP4使用前加热，冷却到室温，使之形成发夹结构；(3)发夹HP1和目标DNA在缓冲溶液中混合，然后在反应的溶液中加入exoIII，溶液中的DNA位点被exoIII切割完成后，使exoIII失活；(4)释放出DNAzyme，释放的DNAzyme与HP3和HP2杂交，加入Zn2+溶液，Zn2+切割发夹DNA上的rA位点。进一步包括如下步骤：(5)S1和S2被释放与HP4杂交；(6)点亮CuNPs。进一步地，步骤(1)中，所有的DNA全部用10mMMOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)PH＝7.6的缓冲溶液，稀释到100μM，储存在4℃中至少24小时后可用。进一步地，步骤(2)中，HP1,HP2,HP3和HP4使用前加热到90℃，10分钟，避免聚集，然后保持恒定摇速2h，让其慢慢冷却到室温，使之形成发夹结构。进一步地，步骤(3)中，包括如下步骤：(3-1)在切割酶(exoIII)辅助的目标放大体系中：1μM的发夹HP1和目标DNA在缓冲溶液中，室温下混合30分钟；(3-2)在反应的溶液中加入12UexoIII，加热到37℃，35分钟；(3-3)溶液中的DNA位点被exoIII切割完成；(3-4)将反应溶液加热到85℃，时间为15分钟，使exoIII失活。进一步地，步骤(4)中，释放出DNAzyme(1)，释放的DNAzyme会与HP3和HP2杂交，加入1nM的Zn2+溶液，Zn2+切割发夹DNA上的rA位点，时间40分钟。进一步地，步骤(5)中，S1和S2将被释放与HP4杂交，形成双通“糖果”结构形成；和/或，步骤(6)中，加入16μL，100mM的抗化学酸钠和8μL，10mΜ的硫酸铜，点亮CuNPs，终体积是260μL。进一步地，步骤(1)之前还包括如下步骤：CSDNACuNPs和polyTCuNPs的制备：a.1DNA和2DNA用10mMMOPS缓冲溶液相互混合在离心管A里，各自的终浓度分别是500Nm；b.将混合溶液放在室温下，20分钟；c.DNA用10mMMOPS缓冲溶液稀释在离心管B里，终浓度分别是1μM；d.在离心管A和B中均加入16μL100mM的抗坏血酸和8μL10mΜ的CuSO4，终体积均为260μL。荧光生物传感器，采用上述制备方法制备得到。上述荧光生物传感器的用途，作为荧光探针用于检测目标DNA。与目前现有技术相比，本专利技术发现了一种新型的“糖果”(CS)造型的DNA结构，相较于传统的聚胸腺嘧啶单链(polyT)为模板的制备发荧光的铜纳米粒子(CuNPs)，该方法增强了CuNPs的荧光信号。基于此事实，我们设计了一种新型的无标记的荧光恢复的生物传感器，该传感器利用了双循环自动放大手段，能够特异性的检测一段特殊序列的DNA。提供基于聚胸腺嘧啶单链(polyT)DNA为基础的“糖果”(CS)DNA结构，相较于传统的polyT为模板的制备CuNPs，CSDNA制备的CuNPs的荧光信号明显增强。可应用于目标DNA的检测。本专利技术公开了一种荧光生物传感器的制备方法及其应用，基于CSDNA结构，我们设计了一种新型的无标记的荧光恢复的生物传感器，该传感器利用了外切酶(exoIII)和金属离子切割的双循环自动放大手段，特异性的检测特殊序列的DNA。该传感器具有很好的灵敏度，而且具有高的选择性，价格低廉和操作简单的特点。附图说明图1A为实施例1制备CSDNA的CuNPs与携带polyT为模板的CuNPs的荧光对比示意图；图1B为基于CSDNA可以增强CuNPs的荧光的现象设计的检测目标DNA的生物传感器；图2A为CSDNACuNPs和polyTCuNPs的荧光激发和发射光谱图；图2B1为CSDNACuNPs和polyTCuNPs的高分辨透射电镜；图2B2为各自的粒子大小分部统计数；图2C为CSDNACuNPs和polyTCuNPs的紫外吸收光谱图；图2D为CSDNACuNPs和polyTCuNPs的圆二色谱图；图2E为CSDNACuNPs和polyTCuNPs的的凝胶电泳；图3A为对CSDNACuNPs头尾DNA互补的碱基配对数对荧光强度的影响的研究；图3B对CSDNACuNPs和polyTCuNPs在不同PH的缓冲溶液中荧光强度的研究；图3C对CSDNACuNPs和polyTCuNPs在不同温度培养下的荧光强度的研究；图4A为基于CSDNACuNPs设计的传感器的可行性图；图4B为该传感器对目标DNA的检测的线性原图；图4C为该传感器对目标DNA的检测的线性方程图；图5为荧光强度图。具体实施方式下面根据附图对本专利技术进行详细描述，其为本专利技术多种实施方式中的一种优选实施例。在一个优选实施例中，荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)、将1DNA溶液和2DNA溶液杂交形成CSDNA与3DNA(携带polyT)，分别加入硫酸铜和抗化学酸以此点亮CuNPs，将两者的荧光强度进行对比；(2)、将步骤(1)制备的CSDNA用于荧光生物传感器的设计中：发夹DNA(HP1)的尾端可以和目标DNA碱基互补配对，加入剪切酶exoIII可以特异性剪切互补配对的发夹DNA，从而释放目标DNA和DNA模拟酶1，释放的目标DNA可以不断进行循环作用。在发夹DNA(HP2和HP3)的加入下，模拟酶的本文档来自技高网...
【技术保护点】
荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)DNA用缓冲溶液稀释到并储存；(2)发夹DNA包括HP1,HP2,HP3和HP4使用前加热，冷却到室温，使之形成发夹结构；(3)发夹HP1和目标DNA在缓冲溶液中混合，然后在反应的溶液中加入exo III，溶液中的DNA位点被exo III切割完成后，使exo III失活；(4)释放出DNAzyme，释放的DNAzyme与HP3和HP2杂交，加入Zn2+溶液，Zn2+切割发夹DNA上的rA位点。
【技术特征摘要】
1.荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)DNA用缓冲溶液稀释到并储存；(2)发夹DNA包括HP1,HP2,HP3和HP4使用前加热，冷却到室温，使之形成发夹结构；(3)发夹HP1和目标DNA在缓冲溶液中混合，然后在反应的溶液中加入exoIII，溶液中的DNA位点被exoIII切割完成后，使exoIII失活；(4)释放出DNAzyme，释放的DNAzyme与HP3和HP2杂交，加入Zn2+溶液，Zn2+切割发夹DNA上的rA位点。2.如权利要求1所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，进一步包括如下步骤：(5)S1和S2被释放与HP4杂交；(6)点亮CuNPs。3.如权利要求1和2所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所有的DNA全部用10mMMOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)PH＝7.6的缓冲溶液，稀释到100μM，储存在4℃中至少24小时后可用。4.如权利要求1-3所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，HP1,HP2,HP3和HP4使用前加热到90℃，10分钟，避免聚集，然后保持恒定摇速2h，让其慢慢冷却到室温，使之形成发夹结构。5.如权利要求1-4所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，包括如下步骤：(3-1)在切割酶(exoIII)辅助的目标放大体系中：1μM的发夹HP1和目标DNA在缓冲溶液中，室温下混合30分钟；(3-2)在反应的溶液中加入12Uex...
【专利技术属性】
技术研发人员：王广凤，万靖，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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