用于包封和释放生物活性大分子的可崩解核/壳二氧化硅颗粒制造技术

本发明专利技术涉及以活性构象包封生物活性大分子或生物活性大分子簇的可崩解核/壳二氧化硅颗粒，用于产生其的方法及其用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】优先权本专利技术要求2014年6月13日提交的欧洲专利申请号EP14305905.3的优先权，将其全部内容通过引证并入本文。
本专利技术涉及可崩解的核/壳二氧化硅颗粒，用于生产其的方法及其用途。本专利技术还涉及使用可崩解二氧化硅壳包封和释放单个或多个生物分子。这种新方法允许递送酶、蛋白质、寡核苷酸以及其它生物分子并保护脆弱的生物分子，以及在触发壳的崩解的刺激时，允许它们全部释放。本专利技术还涉及在用于预防、治疗或美容应用的生物活性大分子的给予中使用的方法和组合物。
技术介绍
在从恢复感兴趣的功能，原位产生高特异性分子到在无任何基因组改变的情况下调控基因表达，改编导致细胞行为的生物和医学应用中，将特异性蛋白直接递送至活细胞具有巨大影响。生物技术和纳米医学中的创新导致基于蛋白质和肽的治疗剂以及其它大分子药物的数目显著增加。此外，预期基因组和蛋白质组技术中最近的发展将继续扩大大分子治疗性候选的通道。作为另一个实例，一些疾病是由重要的酶、蛋白质及其它生物分子的缺乏或低表达所引起的。脆弱、毒性和细胞不透过的生物分子或药物的递送提出了对获得有效的疗法的严重障碍。药物递送涉及给予生物活性分子或药物化合物以在人或动物中实现治疗效果。在生物活性分子，如蛋白质或酶的情况下，使用这类药物的主要复杂之处在于递送至必要的作用位点的困难。在这方面，其需要能够保护生物活性分子或药物化合物的递送系统，需要大量可递送的，并且如果需要能够进一步官能化的材料。生物技术中的创新导致蛋白质和肽治疗剂以及其它大分子药物的数目显著增加。此外，预期基因组和蛋白质组技术中最近的发展将继续增加大分子治疗剂候选的通道。尽管如此，使用大分子通常存在药物开发人员必须克服的一些问题，以成功将这些化合物开发成安全且有效的治疗剂，其不仅是以活性构象将天然、功能性的蛋白或酶有效递送至必要作用位点，其目前仍是挑战。例如，在生理条件下，蛋白质和肽倾向于经历蛋白水解酶的降解作用，或者在更高分子量蛋白质的情况下，可以被中和抗体识别。此外，这些分子可以展现出低溶解度或不良的稳定性，导致较短的保质期。因此，基于大分子的治疗策略经常快速失去它们的有效性或需要频繁的给药。这些因素不但影响疗法的成本，而且影响患者的接受性和依从性，从而影响它们的治疗有用性。为了克服这些问题，适合的递送系统必须能够庇护和保护生物活性分子以保持它们的功能性质，降低对反复注射的需要并允许达到器官而不损害蛋白质的生物活性。因此，对于多种应用，包括医学诊断、生物催化和蛋白递送，蛋白质/酶的稳定性是非常感兴趣的。例如，展现出延长的保质期的基于蛋白质或酶的医学诊断试剂盒可以改善性能并显著降低成本。对于蛋白递送应用，蛋白载体或稳定剂必须满足严格的要求。理想的蛋白质载体必须是不仅无毒和非免疫原性的，并且还必须保护不稳定蛋白质不受天然损害。此外，实际上，通常通过主要在于肺部的毛细管过滤从血液中快速清除较大的蛋白载体(即大于5-7μm)。较小的载体(即小于200nm)，尽管自由循环通过毛细管，但仍面对来自免疫系统的进攻，因而通过吞噬作用快速从血液中清除。因此，能够产生蛋白质和药物长期血液循环的那些载体可以提供多种优势，如增强药物受控释放的效率，提供位点特异的蛋白质递送以及减少对反复注射的需要。目前，主要通过以下实现蛋白质稳定：1)微米和纳米胶囊化(即在脂质体、聚合物或无机结构内)；2)生物结合(即将蛋白质共价键连接至水溶性聚合物或者将蛋白质简单交联以形成稳定的颗粒复合物)；或者3)基因修饰(即遗传性改变蛋白质序列以使其更稳定)。然而，利用基于脂质的胶束的包封策略经常经受问题，如不良的溶液稳定性(特别是在极端温度和pH下)和难以冻干。另外，这些胶束的尺寸分布也非常宽。基于聚合物的包封策略尽管显著改善了冻干能力，但是具有非常差的溶液稳定性，因为聚合物和蛋白质之间仅存在物理相互作用。另一方面，通过使用聚乙二醇或聚氧化乙烯(PEG或PEO)改性的脂质体(即隐形脂质体)或生物可降解/非可降解颗粒(隐形颗粒)，可以显著增强蛋白质的稳定性。然而，对于更有效、精确和胞内的递送目的，这些载体的尺寸仍太大(即处于微米)。蛋白质分子与不同的水溶性聚合物(如PEG和PEO)的生物结合也可以增强蛋白质的稳定性。然而，该方法是非常劳动密集的，并且在一些情况下，该方法可以使蛋白质变性，导致显著的活性损失。通过适当的基因修饰，可以显著改善蛋白质的存放稳定性。不幸地，在大多数情况下，蛋白质活力或特异性也会非常显著地降低。因此目前仍存在对于开发具有改善的稳定性、改善的体内递送特征以及能够经受苛刻环境条件并保持它们活性构象的纳米胶囊化酶及其它纳米胶囊化生物活性大分子的需要。附图说明图1代表根据本专利技术的可崩解混合有机二氧化硅核/壳纳米胶囊的示例性结构的示意图，其显示在材料骨架内存在响应性可裂解连接基。图2代表待并入二氧化硅骨架的壳内的可能的响应性可裂解连接基的实例。图3代表根据本专利技术的包封CyC的可崩解二氧化硅核/壳纳米颗粒的SEM图像(实施例1)。图4代表具有不同的可裂解连接基的比率的包封CyC的可崩解二氧化硅核/壳纳米颗粒的SEM图像。图5代表包封CyC的非可崩解二氧化硅核/壳纳米颗粒的SEM图。图6代表蛋白质溶液和在水中分散的根据本专利技术的包封CyC的可崩解二氧化硅核/壳纳米颗粒的UV-Vis光谱。图7代表在使用和不使用裂解剂(NaBH4或谷胱甘肽)的情况下，搅拌24h后，在水中相同浓度的根据本专利技术的包封CyC的可崩解二氧化硅核/壳纳米颗粒的上清液的UV-Vis光谱。上清液清楚显示壳崩解并从系统释放蛋白质。图8代表在与断裂剂(谷胱甘肽)搅拌24h后，在水中相同浓度的根据本专利技术的包封CyC的可崩解二氧化硅核/壳纳米颗粒和包封CyC的非可崩解二氧化硅核/壳纳米颗粒的上清液的UV-Vis光谱。图9代表在壳体崩解前后，根据本专利技术的包封CyC的可崩解二氧化硅核/壳纳米颗粒的EDX分析。图10代表具有内化的根据本专利技术的包封CyC的可崩解二氧化硅核/壳纳米颗粒的HeLa细胞的共聚焦显微镜图像(桔黄色(在黑白照片上以虚线圆/椭圆表示)，信号来自可崩解壳表面上cy5的发射)。照片上实线圆/椭圆表示蓝色。图11代表根据本专利技术包封TRAIL的可崩解二氧化硅核/壳纳米颗粒的SEM图像。图12代表根据本专利技术包封DNA的可崩解二氧化硅核/壳纳米颗粒的SEM图像。图13代表与根据本专利技术的包封TRAIL的可崩解二氧化硅核/壳纳米颗粒或者根据本专利技术包封CyC的可崩解二氧化硅核/壳纳米颗粒温育24h之后，C6神经胶质瘤细胞的存活率。图14提供了实施例1的材料的表征数据和释放动力学。(A)合成的CyC@BS-NP的SEM图像，(B)完整CyC@BS-NP的HR-TEM图和(C，D)分别用NaBH4溶液处理它们1小时和3小时后，相同颗粒的低温TEM。(E)在水溶液中，用谷胱甘肽处理CyC@BS-NP后，回收的上清液的UV-Vis光谱。所监测的信号是由释放的细胞色素C的平均电子跃迁产生的。插图中为固定波长(λ＝410nm)下，随时间的释放曲线。图15代表细胞内部的内化颗粒的透射电子显微照片。将C6神经胶质瘤细胞与0.1mg/mL颗粒分散液(分别为CyC@BS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纳米胶囊化生物活性大分子或生物活性大分子簇，基本由以下组成：(a)具有核/壳结构的可崩解纳米胶囊，其中所述纳米胶囊的壳由包含Si‑O键的三维骨架的混合有机二氧化硅材料制成，其中所述材料的骨架中至少Si原子的子集通过具有以下结构的连接基连接至所述骨架中的至少另一个Si原子：*‑R1‑L‑R2‑*；其中：每个出现的*表示所述材料的骨架中连接至Si原子的点；L代表响应性可裂解共价键，并且R1和R2独立地代表可选地取代的C1‑20亚烷基部分、可选地取代的C1‑20杂亚烷基部分、可选地取代的亚乙基部分、‑C≡C‑或者可选地取代的苯基部分，其中C1‑20亚烷基、C1‑20杂亚烷基或亚乙基部分可以带有一个或多个选自卤素或‑OR的取代基，其中R可以代表H或C1‑6烷基，并且所述苯基部分可以带有一个或多个独立地选自卤素、C1‑6烷基、‑NO2、‑CN、异氰基、‑ORP、‑N(RP)2的取代基，其中每个出现的RP独立地代表H或C1‑6烷基；以及(b)包封在所述纳米胶囊内的生物活性大分子或生物活性大分子簇，其中所述纳米胶囊内的一种或多种所述生物活性大分子处于活性构象；并且其中所述纳米胶囊的内核不含胶束相。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.13 EP 14305905.31.一种纳米胶囊化生物活性大分子或生物活性大分子簇，基本由以下组成：(a)具有核/壳结构的可崩解纳米胶囊，其中所述纳米胶囊的壳由包含Si-O键的三维骨架的混合有机二氧化硅材料制成，其中所述材料的骨架中至少Si原子的子集通过具有以下结构的连接基连接至所述骨架中的至少另一个Si原子：*-R1-L-R2-*；其中：每个出现的*表示所述材料的骨架中连接至Si原子的点；L代表响应性可裂解共价键，并且R1和R2独立地代表可选地取代的C1-20亚烷基部分、可选地取代的C1-20杂亚烷基部分、可选地取代的亚乙基部分、-C≡C-或者可选地取代的苯基部分，其中C1-20亚烷基、C1-20杂亚烷基或亚乙基部分可以带有一个或多个选自卤素或-OR的取代基，其中R可以代表H或C1-6烷基，并且所述苯基部分可以带有一个或多个独立地选自卤素、C1-6烷基、-NO2、-CN、异氰基、-ORP、-N(RP)2的取代基，其中每个出现的RP独立地代表H或C1-6烷基；以及(b)包封在所述纳米胶囊内的生物活性大分子或生物活性大分子簇，其中所述纳米胶囊内的一种或多种所述生物活性大分子处于活性构象；并且其中所述纳米胶囊的内核不含胶束相。2.根据权利要求1所述的纳米胶囊化生物活性大分子，其中，所述连接基具有结构*-R1-L-R2-*，并且L代表响应性可裂解共价键，其选自：3.根据权利要求1或2所述的纳米胶囊化生物活性大分子，其中，在具有结构*-R1-L-R2-*的所述连接基中，R1和R2相同，并且各自表示-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-或苯基。4.根据权利要求1至3中任一项所述的纳米胶囊化生物活性大分子，其中大分子选自由蛋白质、酶、抗体、肽、DNA、RNA和基因片段组成的组。5.根据权利要求1至4中任一项所述的纳米胶囊化生物活性大分子，其中，纳米胶囊壳具有25纳米至500纳米之间的直径。6.根据权利要求1至5中任一项所述的纳米胶囊化生物活性大分子，其中，纳米胶囊壳是在施加刺激时可崩解的，并且大分子保持高度折叠并且处于非变性状态。7.根据权利要求1至6中任一项所述的纳米胶囊化生物活性大分子，其中，纳米胶囊壳是在施加刺激时可崩解的，并且大分子保持折叠位置并保留活性构象，其中所述刺激选自pH变化(升高或降低)、氧化还原电势变化、还原剂或氧化剂的存在、UV光或近红外光的存在、酶促裂解或温度变化。8.根据权利要求1至7中任一项所述的纳米胶囊化生物活性大分子，在其外表面用PEG、抗体或RNA部分进一步官能化。9.一种药物或美容组合物，包含根据权利要求1至8中任一项所述的纳米胶囊化生物活性大分子，以及药学或美容上可接受的载体。10.一种用于制备根据权利要求1至8中任一项所述的纳米胶囊化生物活性大分子或根据权利要求9所述的组合物的方法，包括以下步骤：a)由(i)除磷脂外适合的表面活性剂和醇在适合的有机溶剂中的溶液，和(ii)生物活性大分子或生物活性大分子簇、硅烷前体Si(XA)4和具有结构(X)3Si-R1-L-R2-Si(X)3的选择的前体的水溶液产生油包水乳剂；b)在碱性条件下，搅拌在步骤a)中获得的油包水乳剂；从而用通过烷氧基硅的水解-缩合获得的有机二氧化硅溶胶-凝胶混合物包覆所述生物活性大分子或生物活性大分子簇；以及c)加入适合的有机溶剂，从而使所述纳米胶囊化生物活性大分子或生物活性大分子簇沉淀；其中：每个出现的X和XA独立地代表可水解或非可水解基团，条件是在前体(X)3Si-R1-L-R2-Si(X)3的每个出现的Si上，至少一个出现的X代表可水解基团，并且前体Si(XA)4中至少两个出现的XA独立地代表可水解基团；其中(i)当X或XA代表非可水解基团时，其可以选自可选地取代的C1-20烷基、C2-20烯基或C2-20炔基部分、可选地取代的C1-20杂烷基、C2-20杂炔基或C2-20杂炔基部分或可选地取代的苯基部分，其中苯基、烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基和杂炔基部分上的取代基可以独立地选自卤素、-...

【专利技术属性】
技术研发人员：路易莎·德古拉，埃科·阿迪·普拉塞蒂扬托，亚历山德罗·贝尔图奇，德迪·塞普亚迪，
申请(专利权)人：斯特拉斯堡大学，
类型：发明
国别省市：法国;FR