用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染的组合物制造技术

本发明专利技术涉及：含有与壁磷壁酸(WTA)连接的肽聚糖(PGN)作为活性成分的组合物；通过使用所述组合物用于预防或治疗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染的方法；以及用于制备可用作所述组合物中活性成分的可溶性与壁磷壁酸连接的肽聚糖(WTA‑PGN)的方法。本发明专利技术的组合物可通过以下用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染：由抗原‑抗体反应引起的调理吞噬作用；以及在感染早期期间由T细胞活化引起的中性粒细胞介导的吞噬作用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于预防或治疗金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)感染性疾病的组合物，更具体地涉及包含与壁磷壁酸连接的肽聚糖(wallteichoicacid-attachedpeptidoglycan，以下称为WTA-PGN)作为活性成分的组合物，使用所述组合物用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的方法，以及用于制备可用作组合物中活性成分的可溶性WTA-PGN的方法。
技术介绍
金黄色葡萄球菌可在人皮肤、软组织和血流中引起严重的感染(LowyFD，TheNewEnglandjournalofmedicine，339：520-532，1998)。另外，金黄色葡萄球菌可变成耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)菌株，其耐甲氧西林(一种β-内酰胺类抗生素)，并且这样的MRSA感染难以治疗并且具有不良预后，因此成为大的社会问题。特别地，在未住院的儿童等中已经出现了社区相关MRSA(community-associatedMRSA，CA-MRSA)，与常规的医院相关MRSA(hospital-associatedMRSA，HA-MRSA)一起使得治疗更加困难。最近在美国传播的USA300MRSA菌株已经在儿童或免疫抑制的人中诱导严重的疾病，因此需要开发具有预防和治疗MRSA感染之作用的新疫苗。虽然由外国研究人员开发的金黄色葡萄球菌的疫苗候选物在临床试验中显示良好的预后，但它们都未能通过临床试验，因此迄今为止还没有开发出用于金黄色葡萄球菌的临床有效的疫苗。最近的研究表明，体液和细胞免疫对于作为金黄色葡萄球菌疫苗起作用均是必需的，其中体液免疫通过产生对特定疫苗候选物质特异性的血清抗体加速调理吞噬作用，并且细胞免疫募集中性粒细胞并通过在MRSA感染的早期产生T细胞介导的IL-17A来加速吞噬作用，并且通过T细胞活化来加速吞噬细胞效应子功能可提供针对金黄色葡萄球菌感染的保护。此外，外国研究人员报道，金黄色葡萄球菌感染可以提高小鼠模型中记忆性γδ-T细胞的数量，从而表现出对感染的保护作用(J.Immunol.，192(8)：3697-3708，2014)。该结果表明，暴露于金黄色葡萄球菌以类似于αβT细胞的方式诱导γδ-T细胞的记忆性应答，并且产生IL-17A的记忆性γδ-T细胞的诱导可表现出抵抗金黄色葡萄球菌的强的宿主保护作用。然而，迄今为止尚未知道金黄色葡萄球菌的什么材料表现出这样的保护作用。与革兰氏阴性菌不同，革兰氏阳性菌(例如金黄色葡萄球菌)的细胞壁主要由四种组分组成，包括肽聚糖(peptidoglycan，PGN)、壁磷壁酸(wallteichoicacid，WTA)、脂磷壁酸(lipoteichoicacid，LTA)和荚膜多糖(capsularpolysaccharide，CP)。通过宿主的生物防御蛋白迅速识别侵入性病原体，并通过选择性活化固有免疫如补体系统迅速去除病原体是非常重要的反应。然而，由宿主中的体内防御蛋白识别的细菌的配体材料尚未被清楚地鉴定，因此在预防和治疗由病原体引起的感染性疾病中存在困难。特别地，作为金黄色葡萄球菌细胞壁组分的配体(例如WTA、LTA、PGN、CP和脂蛋白等)主要是具有复杂结构的糖聚合物，并且与其它材料一起被纯化，因此难以作为单一的材料分离/纯化。另外，由于多种类型的细胞壁组分暴露于外部，不容易鉴定哪些组分可作为宿主的体内防御蛋白的配体。本专利技术的专利技术人已从金黄色葡萄球菌的特定突变菌株中分离WTA-PGN，并且已经证实WTA-PGN可用作能够诱导针对金黄色葡萄球菌感染的早期体内免疫应答的宿主的体内防御蛋白的配体，从而有效地用于预防和治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病。
技术实现思路
技术问题因此，本专利技术的目的是提供用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的组合物。本专利技术的另一个目的是提供使用所述组合物用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的方法。本专利技术的另一个目的是提供用于制备可用作组合物中的活性成分的可溶性WTA-PGN的方法。问题的解决方案为了实现上述目的，本专利技术提供了用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的组合物，其包含WTA-PGN作为活性成分。另外，本专利技术提供了预防或治疗金黄色葡萄球菌感染性疾病的方法，其包括向有此需要的对象施用上述组合物。此外，本专利技术提供了用于制备可溶性WTA-PGN的方法，其包括以下步骤：(1)获得其中脂蛋白二酰基甘油转移酶(lgt)和O-乙酰转移酶(oatA)基因从野生型金黄色葡萄球菌中缺失的具有双突变的菌株；(2)破坏所述带有双突变的菌株并从被破坏的菌株中获得不溶性WTA-PGN；(3)用β-裂解酶处理所述不溶性WTA-PGN；(4)从步骤(3)中经酶处理的产物中获得包含可溶性WTA-PGN的级分；(5)用溶菌酶或变溶菌素处理所述包含可溶性WTA-PGN的级分；以及(6)从步骤(5)中经酶处理的产物获得可溶性WTA-PGN。附图简述结合附图，通过下文对本专利技术的描述，本专利技术的上述目的和特征将变得显而易见，其中分别示出了：图1是展示金黄色葡萄球菌的细胞壁结构的示意图。图2是展示从具有RN4220Δlgt/Δoat突变的菌株中获得可溶性WTA-PGN、可溶性WTA和可溶性PGN的各过程的流程图。图3示出了用β-裂解酶处理不溶性WTA-PGN后，通过HiTrap-Q柱分离的不溶性WTA-PGN的洗脱模式(A)，和洗脱级分的凝胶迁移率(B)；以及用溶解酶处理经β-裂解酶处理的WTA-PGN后通过HiTrap-Q柱分离的WTA-PGN的洗脱模式(C)和凝胶迁移率(D)。图4示出了通过SephacrylS-200HR柱分离的WTA-PGN的洗脱模式(A)和凝胶迁移率(B)；以及在小鼠腹膜内注射WTA-PGN时IL-17A产生量的定量结果(C)。图5示出了通过第一反相柱分离的WTA-PGN的洗脱模式(5A)和凝胶迁移率(5B)；通过第二反相柱分离的WTA-PGN的洗脱模式(5C)和凝胶迁移率(5D)；以及在小鼠腹膜内注射WTA-PGN时诱导的IL-17A产生量的定量结果(5E)。图6示出了在用三氯乙酸(trichloroaceticacid，TCA)处理不溶性WTA-PGN之后，通过HiTrap-Q柱分离的WTA-PGN的洗脱模式(A)和凝胶迁移率(B)。图7示出了通过Hitrap-Q柱分离的可溶性PGN的洗脱模式。图8示出了通过ToyopearlHW55S柱分离的可溶性PGN的洗脱模式。图9分别示出了WTA-PGN和WTA的27％PAGE和硝酸银染色(A)、硅胶薄层色谱(B)和磷酸盐和GlcNAc的残余量(C)。图10示出了WTA、PGN和WTA-PGN的3次腹膜内免疫接种的时间表；和MRSA(USA300)感染以用于观察γδT细胞诱导的初始免疫应答(细胞免疫)和记忆免疫应答。图11示出了根据多种浓度和时间的通过腹膜内注射PBS、WTA-PGN以及WTA和PGN的混合物诱导的小鼠中IL-17A(11A)和IL-1β(11B)的产生。图12示出了注射WTA-PGN后随时间的IL-17A、IL-1β和IL-10产生。图13示出了通过流式细胞术分析法分析注本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于预防或治疗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染性疾病的组合物，其包含与壁磷壁酸连接的肽聚糖(WTA‑PGN)作为活性成分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.29 US 62/004,564;2014.08.22 US 62/040,452;1.用于预防或治疗金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)感染性疾病的组合物，其包含与壁磷壁酸连接的肽聚糖(WTA-PGN)作为活性成分。2.权利要求1所述的组合物，其中所述WTA-PGN如以下通式1所示：[通式1]其中n为10至50的整数；m为1至3的整数；A为N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)；B为N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)；O和P各自独立地为0至5的整数；R1至R3各自独立地为羟基、四肽或五肽；且R4为羟基或N-乙酰胞壁酸(MurNAc)。3.权利要求2所述的组合物，其中A和B通过β位彼此连接。4.权利要求2所述的组合物，其中n为35至45的整数；m为3；A为N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)；B为N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)；O和P各自独立地为0至5的整数；R1至R3各自独立地为羟基、四肽或五肽；且R4为羟基或N-乙酰胞壁酸(MurNAc)。5.权利要求4所述的组合物，其中n为40；m为3；A为N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)；B为N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)；O和P各自独立地为0至5的整数；R1和R2各自独立地为四肽；R3为羟基、四肽或五肽；且R4为羟基或N-乙酰胞壁酸(MurNAc)。6.权利要求5所述的组合物，其中所述四肽是-A1-A2-A3-A4，其中A1是Ala或Gly，A2是Glu或Asp，A3是Lys、Arg或His，且A4是Ala或Gly。7.权利要求5所述的组合物，其中所述四肽是-(L-Ala)-...

【专利技术属性】
技术研发人员：李福律，李民姿，李宗虎，成慜荣，安东浩，高桥和枝，黑川健儿，
申请(专利权)人：株式会社绿十字，釜山大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国;KR