本发明专利技术涉及一种基于核酸适配体的痕量农药残留表面增强拉曼光谱检测方法，属于农药检测领域。本发明专利技术以拉曼活性染料标记的金纳米颗粒作为增强基底，利用农药与适配体的特异性结合，导致活性染料标记的金纳米颗粒在盐溶液中的聚集差异；通过便携式拉曼光谱仪，得到相应活性染料的SERS谱图，实现对痕量农药的定量检测，并在茶叶实际样品中进行方法可行性验证。本发明专利技术提供的检测方法，能将传统拉曼技术中以检测目标物的拉曼特征峰作为定量判断的常规思路转变为以活性染料标记物的拉曼特征峰作为目标物检测的定量标准，不仅提高了检测灵敏度，简化了复杂增强基底制备流程，更为痕量农药残留在食品及工业领域的研究、检测、监管等提供了方便。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种针对农药残留的拉曼光谱检测方法，特指基于核酸适配体的痕量农药残留表面增强拉曼光谱(SERS)检测方法，属于农药检测领域。
技术介绍
农药，以其在农作物增收与病虫害防治方面的突出贡献，使得其在国内外农业生产与耕种中广泛使用。然而，当农药在保障蔬菜增收，粮食丰产的同时，农药残留现象也随之而来。广泛而严重的农药残留问题，带来的不仅是生态环境方面的担忧，更为严重的是残留农药通过被动摄入或者富集的方式从自然界转入体内而引发的食品安全隐患。目前，我国农药检测方法主要是传统的检测方式，包括：气相、液相及其质谱联用等方法，它们可以实现农药的准确残留检测，但需要复杂昂贵的仪器设备及专业操作人员，加之样品前处理繁琐费时、检测费用高，难以满足现场、低成本检测的需要。而基于抗原抗体的免疫分析方法虽然特异性高，却存在假阳性，价格高的缺点。拉曼光谱技术是一项具有高灵敏度，易操作性，低成本检测等多种优点的光谱技术，并广泛应用于医学、生物、环境、考古等多个领域。其中，表面增强拉曼光谱(SERS)技术的发现，更是推动了拉曼光谱技术在单个分子探测、痕量物质检测方面的应用与发展。目前，单一的纳米金/银胶体作为增强基底的应用已十分广泛，而具有标记物的拉曼增强基底结合核酸适配体的痕量农药残留检测方式却鲜见报道。本专利技术作为一种新颖的痕量农药残留拉曼检测方法，不仅从一定程度上提升了表面增强拉曼技术检测效率，同时扩宽了痕量农药残留的检测思路。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于核酸适配体的痕量农药残留表面增强拉曼光谱检测方法，其基底材料合成简单、检测灵敏度高、操作方便、成本低廉、特异性强，广泛适用于食品及工业领域的研究、检测、监管等。为了实现上述目的，本专利技术采用表面增强拉曼光谱技术，该方法利用标记物标记的纳米材料作为增强基底，通过农药与适配体的特异性识别结合，影响纳米材料在检测体系中的电荷分布平衡，从而引起标记物标记的纳米材料在不同检测农药浓度下的聚集差异；不同聚集程度的增强基底可对拉曼信号进行不同程度的放大，依据不同拉曼强度的标记物拉曼特征峰图谱，实现对痕量农药进行灵敏间接定量检测的目的。同时，该方法应用于茶叶样品的检测，以验证其方法在实际应用中的可靠性。上述的基于核酸适配体的痕量农药残留表面增强拉曼光谱检测方法，所述的拉曼增强基底是拉曼活性染料结晶紫吸附的金纳米颗粒。上述的基于核酸适配体的痕量农药残留表面增强拉曼光谱检测方法，所述的痕量农药与其相应适配体特异性结合的表征是采用圆二色谱。上述的基于核酸适配体的痕量农药残留表面增强拉曼光谱检测方法，所述的痕量农药是啶虫脒，适配体的序列是：5’-TGT AAT TTG TCT GCA GCG GTT CTT GAT CGC TGA CAC CAT ATT ATG AAG A-3’。上述的基于核酸适配体的痕量农药残留表面增强拉曼光谱检测方法，其具体步骤如下：1)增强基底的制备：采用柠檬酸三钠加热还原法进行金纳米颗粒的制备。在制备过程中，保持浓度为0.02％(M/V)氯金酸溶液与2.3mL的1％(M/V)的柠檬酸三钠溶液混合以制备粒径大小合适(约为30nm)的金纳米颗粒；并将20μL 0.8μM的拉曼活性染料结晶紫溶液和100μL制备所得的金纳米颗粒混合，使得拉曼活性染料结晶紫以静电吸附的形式吸附于金纳米颗粒的表面。2)检测方法的表征：在此，农药与核酸适配体的特异性结合采用圆二色谱表征：用含有10mM氯化钠和5mM氯化镁的10mM Tris缓冲溶液配制在离心管(1.5mL)中配置等量的核酸适配体溶液；随后，在其中一管中加入5μM啶虫脒农药，另一管加入等量的超纯水，最后于230nm-300nm波长范围下进行圆二色谱图检测。不同聚集状态的增强基底采用透射电镜图像拍摄：吸取一定量的不同检测体系的混合溶液，将其滴加到铜网上，进行透射图像拍摄。3)拉曼光谱的检测：首先，20μL不同浓度的啶虫脒溶液于相同基体的4μL核酸适配体混合反应30分钟。随后，加入增强基底液，并将此混合体系漩涡均匀，置于室温下继续反应8分钟。在此阶段，与啶虫脒特异性识别的核酸适配体其核酸结构发生变化，未与啶虫脒特异性识别的核酸适配体以静电吸附的形式吸附于金纳米颗粒的表面。最后，加入20μL 350mM的氯化钠(NaCl)溶液与20μL超纯水使其检测体系的总体积为200μL。将该检测体系充分混合后，置于微量比色皿中进行拉曼光谱检测。在此，拉曼光谱的激光波长设定为785nm。4)实际样品的检测：实际茶叶样品痕量农药残留的检测采用标准加入法。首先，准确称取5g经烘箱烘干至恒重的茶叶样品，并将其与150mL二氯甲烷(CH2Cl2)混合超声提取45min；随后，对混合液进行过滤，留取滤液，并用澄清的提取液配制一定浓度的啶虫脒混合液；接着，取一半上述啶虫脒混合液进行旋转蒸发浓缩，并将所得浓缩物用含一定量甲醇(CH3OH)的超纯水对其进行稀释；最后，按照步骤3)进行拉曼光谱检测，从而实现对实际样品中痕量农药残留的定量检测。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的拉曼活性染料结晶紫吸附的金纳米颗粒基底，一方面能够利用纳米颗粒间的等离激元耦合电磁场的加强调整表面增强拉曼散射信号；另一方面利用吸附的拉曼活性染料结晶紫，能将传统拉曼技术中以检测目标物的拉曼特征峰作为定量判断的常规思路转变为以标记物的拉曼特征峰作为目标物检测的定量标准，该利用标记峰代替物质特征峰的创新思路不仅提高了检测灵敏度，简化了基底制备与化学修饰的步骤，并且避免了复杂检测环境下背景物质的荧光干扰。本专利技术采用圆二色谱表征农药与核酸适配体的特异性结合，利用获得光谱能够直接获取农药与核酸适配体的特异性结合以及核酸构象变化信息；采用透射电镜拍摄不同检测体系的图像，利用获得图像可直观获得不同聚集状态的增强基底信息。该两种表征方法为实验的可行性分析提供方便高效的观测手段。本专利技术引用核酸适配体作为特异性识别探针，一方面能够稳定纳米材料在检测系统中的分散状态；另一方面能够高特异性地识别检测目标物，合成成本低，化学性质稳定，且适用扩展至其他目标物的检测。本专利技术设计的基于核酸适配体的痕量农药残留表面增强拉曼光谱检测方法，操作流程简单，检测可信度强，可在食品及工业领域的研究、检测、监管等方向广泛应用。附图说明图1是实施例的核酸适配体与啶虫脒特异性结合表征；图2是实施例的啶虫脒拉曼标准曲线；图3是实施例的表面增强拉曼曲线图与对应透射电镜检测原理表征图：(A)增强基底a与增强基底-氯化钠b溶液体系的表面增强拉曼曲线图与其对应透射电镜检测原理表征图；(B)核酸适配体-增强基底-氯化钠c与啶虫脒-核酸适配体-增强基底-氯化钠d溶液体系的表面增强拉曼曲线图与其对应透射电镜检测原理表征图。具体实施方式本专利技术对痕量农药残留具有通用性，但由于农药种类较多，本专利技术只选用了主流农药类别中最为广泛使用的啶虫脒作为实施实例，其他农药的检测可以参考该实施实例的方法。实例实施步骤结合附图进行详细描述。(1)金纳米颗粒的制备采用柠檬酸三钠加热还原法进行金纳米颗粒的制备。首先，用新配制的王水(1:3HNO3/HCl)浸泡制备中所需使用的玻璃器皿，并在使用前用蒸馏水进行冲洗，于空气中干燥后使用。其次，取0.0200g氯金酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于核酸适配体的痕量农药残留表面增强拉曼光谱检测方法，其特征在于，该方法利用标记物标记的纳米材料作为增强基底，通过农药与适配体的特异性识别结合，影响纳米材料在检测体系中的电荷分布平衡，从而引起标记物标记的纳米材料在不同检测农药浓度下的聚集差异；不同聚集程度的增强基底可对拉曼信号进行不同程度的放大，依据不同拉曼强度的标记物拉曼特征峰图谱，实现对痕量农药进行灵敏间接定量检测的目的。
【技术特征摘要】
1.一种基于核酸适配体的痕量农药残留表面增强拉曼光谱检测方法，其特征在于，该方法利用标记物标记的纳米材料作为增强基底，通过农药与适配体的特异性识别结合，影响纳米材料在检测体系中的电荷分布平衡，从而引起标记物标记的纳米材料在不同检测农药浓度下的聚集差异；不同聚集程度的增强基底可对拉曼信号进行不同程度的放大，依据不同拉曼强度的标记物拉曼特征峰图谱，实现对痕量农药进行灵敏间接定量检测的目的。2.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的痕量农药残留表面增强拉曼光谱检测方法，其特征在于，增强基底为拉曼活性染料结晶紫吸附的金纳米颗粒。3.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的痕量农药残留表面增强拉曼光谱检测方法，其特征在于，采用圆二色谱表征农药与核酸适配体的特异性识别结合。4.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的痕量农药残留表面增强拉曼光谱检测方法，其特征在于，痕量农药为啶虫脒，核酸适配体序列为：5’-TGT AAT TTG TCT GCA GCG GTT CTT GAT CGC TGA CAC CAT ATT ATG AAG A-3’。5.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的痕量农药残留表面增强拉曼光谱检测方法，其特征在于，检测方法包括如下具体步骤：1)增强基底的制备：采用柠檬酸三钠加热还原法进行金纳米颗粒的制备。在制备过程中，保持浓度为0.02％(M/V)氯金酸溶液与2.3mL的1％(M/V)的柠檬酸三钠溶液混合以制备粒径大小合适的金纳米颗粒，约为30nm；并将20μL 0.8μM的拉曼活性染料结晶紫溶液和100μL制备所得的金纳米颗粒混合，使得拉曼活性染...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡薇薇，陈全胜，李欢欢，张彬，欧阳琴，赵杰文，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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