一种单组份TMB显色液及其制备方法技术

本发明专利技术公开一种单组份TMB显色液，包含TMB，所述单组份TMB显色液还包含抗氧化肽。本发明专利技术所述TMB显色液添加了抗氧化肽作为抗氧化剂，可防止TMB的氧化，使本发明专利技术中的TMB能稳定保存24个月，同时，在终止反应后能稳定放置3小时以上，与现有TMB需在终止反应后30min内读数更加方便，更具灵活性。同时，本发明专利技术还公开了所述单组份TMB显色液的制备方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物体外诊断试剂及其制备方法，尤其是一种单组份TMB显色液及其制备方法。
技术介绍
TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)是一种新型安全的色原试剂，作为过氧化物酶的新底物，在酶联免疫吸附检测(ELISA)中获得了广泛应用。底物产生一种可溶性淡蓝色的末端产物，可在370或630nm在分光光度计上读取。其适用于酶联免疫反应中的显色阶段的定量和定性分析。其检验的原理是：当标记在抗体或抗原上的酶与显色液中的TMB、双氧水等反应，加入终止液后溶液由无色变成黄色，黄色深浅反应ELISA体系中抗原抗体结合的多少，从而判断某种抗原或抗体的多少。在通过酶标仪测度吸光值，判断免疫反应的程度。现有市售的酶联免疫试剂盒所采用TMB显色剂液分为两种，一种为双组份，分A液和B液，使用之前需要先混匀，由于在使用上易造成操作不方便，且混合后保存时间短等缺点，逐渐被第二种取代；第二种即为单组份TMB，操作方便，但目前市面上所使用的单组份TMB稳定性差，保存时间短，大部分的保存时间在3-6个月，且显色背景高，均一性不好。TMB为脂溶性化合物，难溶于水，且容易在空气环境中被氧化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种TMB溶解度高、TMB溶液稳定性强、反应终止后结果能稳定保存一段时间、读数更加方便的单组份TMB显色液；同时，本专利技术还提供了所述单组份TMB显色液的制备方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种单组份TMB显色液，包含TMB，所述单组份TMB显色液还包含抗氧化肽。生物体内具有许多蛋白质类抗氧化活性物质。随着对蛋白酶解技术的深入研究，人们发现，介于蛋白质和氨基酸间的肽类，与其他生物分子如氨基酸、大分子蛋白质等相比较具有极强的活性和多样性，动植物蛋白水解所得的具有一定生理活性的功能性多肽及寡肽产品被广泛开发利用，如具有抑制血压升高的食品，及有特殊氨基酸组成的、可以作为患者营养补剂的寡肽等。随着人们发现某些蛋白质具有清除生物体内过量的游离基，抑制脂质氧化的作用后，肽的抗氧化性的研究成为一大热点。本专利技术采用抗氧化肽作为TMB的抗氧化剂，防止TMB被O2-和OH-氧化，提高了TMB溶液的稳定性和反应终止后检测信号的稳定性，提高了检测的灵敏度。本专利技术所用抗氧化肽，可为各种长度的抗氧化肽，使用不同长度的抗氧化肽时，添加的浓度略不同，实际操作过程中，本领域技术人员根据具体所用抗氧化肽的长度进行适当调整即可。优选地，所述抗氧化肽选择短肽，因为抗氧化肽多以短肽形式出现，长链的多肽抗氧化性能会弱一些，一般10个氨基酸以下的抗氧化肽的抗氧化能力都很强，因此，本专利技术优选10个氨基酸以下的抗氧化肽。更优选地，本专利技术选择2～7个氨基酸的抗氧化肽。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述抗氧化肽在TMB显色液中的浓度为1.0～50nmol/L。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的更优选实施方式，所述抗氧化肽在TMB显色液中的浓度为1.0～20nmol/L。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述单组份TMB显色液还包含吐温80和羟丙基-β-环糊精。本专利技术的单组份TMB显色液，通过引入吐温-80及羟丙基-β-环糊精助溶TMB，使本专利技术的单组份TMB显色液形成稳定的水溶液体系，同时羟丙基-β-环糊精有1个“内疏水、外亲水”的特殊立体环状结构，能够对脂溶性的TMB进行包合，从而提高TMB分子的水溶性、稳定性和抗氧化、抗光解能力，配合其它组分可使本专利技术在2-8℃下，能保存24个月。同时羟丙基-β-环糊精作为稳定剂，能使TMB显色液在强酸终止反应后，信号稳定时间可长达3h以上。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述吐温-80在TMB显色液中的质量浓度为1～15g/L；所述羟丙基-β-环糊精在TMB显色液中的质量浓度为2～9g/L。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的更优选实施方式，所述吐温-80在TMB显色液中的质量浓度为4～10g/L；所述羟丙基-β-环糊精在TMB显色液中的质量浓度为2.5～5g/L。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述单组份TMB显色液还包含DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸和过氧化氢；所述DMSO在TMB显色液中的体积浓度为5～40ml/L；所述磷酸氢二钠在TMB显色液中的摩尔浓度为0.05-0.1mol/L；所述柠檬酸在TMB显色液中的摩尔浓度为0.03-0.05mol/L；所述过氧化氢在TMB显色液中的体积浓度为1-1.25ml/L；所述TMB在所述TMB显色液中的质量浓度为0.1-1g/L。二甲基亚砜(DMSO)是一种含硫有机化合物，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为\万能溶剂\。采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液作为基础溶液，来溶解各物质成分。TMB在过氧化氢的存在下，被氧化成最终产物。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的更优选实施方式，所述DMSO在TMB显色液中的体积浓度为10～20ml/L；所述TMB在所述TMB显色液中的质量浓度为0.1-0.4g/L。本专利技术人经过大量实验研究发现，各物质在此含量范围内，TMB显色液的各项性能达到最优。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述TMB显色液的pH为2.5-4.8。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的更优选实施方式，所述TMB显色液的pH为3.8-4.2。同时，本专利技术还提供一种如上所述TMB显色液的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)配制磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠、柠檬酸溶于去离子水中，用HCl调节pH至2.5～3.0，即得磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；(2)称取吐温-80、羟丙基-β-环糊精和抗氧化肽，边搅拌边将其加入到步骤(1)所得的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，将其溶解直到溶液不再含有微小颗粒；(3)称取TMB，加入DMSO，使之充分溶解；(4)将步骤(3)所得的溶液加入步骤(2)所得的溶液中，充分搅拌，直到溶液不再含有微小颗粒；(5)在步骤(4)所得溶液的上液中加入过氧化氢，边加入边搅拌，使之充分溶解；(6)用稀盐酸调节pH至2.0-4.8，加纯水定容；(7)过滤获得均一的溶液，即为单组份TMB显色液。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的制备方法的优选实施方式，所述步骤(6)中用稀盐酸调节pH至3.8～4.2，然后再加纯水定容。本专利技术所述TMB显色液，通过抗氧化剂抗氧化肽的使用，可防止TMB的氧化，使本专利技术中的TMB能稳定保存24个月，同时，在终止反应后能稳定放置3小时以上，与现有TMB需在终止反应后30min内读数更加方便，更具灵活性。本专利技术所述单组份TMB显色液的制备方法，操作方便，能够快速高效制备得到本专利技术的单组份TMB显色液。具体实施方式为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1本专利技术单组份TMB显色液的一种实施例，本实施例所述单组份TMB显色液包含以下成分：TMB、吐温80、羟丙基-β-环糊精、抗氧化肽、DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸、过氧化氢；其中，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单组份TMB显色液，包含TMB，其特征在于，所述单组份TMB显色液还包含抗氧化肽。

【技术特征摘要】
1.一种单组份TMB显色液，包含TMB，其特征在于，所述单组份TMB显色液还包含抗氧化肽。2.如权利要求1所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述抗氧化肽在单组份TMB显色液中的摩尔浓度为1.0～50nmol/L。3.如权利要求2所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述抗氧化肽在单组份TMB显色液中的摩尔浓度为1.0～20nmol/L。4.如权利要求1～3任一项所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述单组份TMB显色液还包含吐温80和羟丙基-β-环糊精。5.如权利要求4所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述吐温-80在TMB显色液中的质量浓度为1～15g/L；所述羟丙基-β-环糊精在TMB显色液中的质量浓度为2～9g/L。6.如权利要求5所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述吐温-80在TMB显色液中的质量浓度为4～10g/L；所述羟丙基-β-环糊精在TMB显色液中的质量浓度为2.5～5g/L。7.如权利要求1-6任一项所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述TMB显色液还包含DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸和过氧化氢；所述DMSO在TMB显色液中的体积浓度为5～40ml/L；所述磷酸氢二钠在TMB显色液中的摩尔浓度为0.05-0.1mol/L；所述柠檬酸在TMB显色液中的摩尔浓度为0.03...

【专利技术属性】
技术研发人员：李民友，张玲，李妙红，蓝媛，齐宗献，
申请(专利权)人：广州市进德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44