单组份TMB显色液及其配制方法技术

本发明专利技术涉及一种单组份TMB显色液及其配制方法。该单组份TMB显色液包括以下组分：TMB、二甲基亚砜、甘油、氧化剂、糖类化合物或其衍生物、缓冲液；所述单组份TMB显色液的pH值为3.0‑7.0；所述缓冲液选自柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸‑EDTA缓冲液、柠檬酸‑乙酸钠缓冲液或柠檬酸‑磷酸氢二钠缓缓冲液；所述糖类化合物或其衍生物选自糖苷或其衍生物、葡聚糖或其衍生物和聚蔗糖或其衍生物中的至少一种。所述单组份TMB显色液能够用于Western、IHC或原位杂交等实验，灵敏度高、稳定性好、保存时间长。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物体外诊断试剂
，特别是涉及一种单组分TMB显色液及其制备方法。
技术介绍
在分子生物学与病理领域中，进行Western、免疫组化(IHC)或原位杂交等试验时，传统的方法一般使用DAB(3,3’-二氨基联苯胺)作为辣根过氧化物酶(HRP)的显色底物，在显色反应中产生棕色沉淀。DAB具有一定的致癌性，而且DAB作为HRP的底物，配成溶液后稳定性差，灵敏度也比较低。TMB(3,3\,5,5\-四甲基联苯胺)是一种无致癌特性的试剂，也是HRP的显色底物之一，具有高灵敏度的特性，因此被广泛用于ELISA反应(酶联免疫反应)。现有市售的酶联免疫试剂盒所采用的TMB显色液大多为双组份，分A液和B液，使用之前需要先混匀，因此存在以下缺点：使用不够方便、提高了包装材料的成本、浪费资源，且使用中的混合过程容易造成批间质量不均一。市售的酶联免疫试剂盒也有采用单组份的TMB显色液，但是现有的单组份TMB显色液存在稳定性差、保存时间短、显色背景高、灵敏度低等问题。而且，TMB与HRP作用后只产生蓝色溶液而不能产生沉淀，因此，传统的TMB显色液只能用于ELISA反应，而不能用于Western、免疫组化(IHC)或原位杂交等实验。
技术实现思路
基于此，本专利技术提供了一种单组份TMB显色液，该显色液可用于Western、免疫组化(IHC)或原位杂交等实验。具体技术方案如下：一种单组份TMB显色液，包括以下组分：0.1-2mg/mL TMB、体积分数为0.1-3％的二甲基亚砜、体积分数为1-10％的甘油、0.01-0.5mg/ml氧化剂、0.5-10mg/mL糖类化合物或其衍生物、0.1-2.5mol/L缓冲液；所述单组份TMB显色液的pH值为3.0-7.0；所述缓冲液选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-EDTA缓冲液、柠檬酸-乙酸钠缓冲液或柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；所述糖类化合物或其衍生物选自糖苷或其衍生物、葡聚糖或其衍生物和聚蔗糖或其衍生物中的至少一种。在其中一些实施例中，所述糖类化合物或其衍生物选自葡聚糖或其衍生物。在其中一些实施例中，所述葡聚糖或其衍生物选自DEAE葡聚糖盐酸盐或右旋糖酐。在其中一些实施例中，所述缓冲液选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。在其中一些实施例中，所述氧化剂选自过氧化氢、过氧化脲和过硼酸钠中的至少一种。在其中一些实施例中，所述氧化剂选自过氧化脲。在其中一些实施例中，所述单组份TMB显色液包括以下组分：0.3-0.5mg/mL TMB、体积分数为0.4-0.6％的二甲基亚砜、体积分数为8-10％的甘油、0.3-0.4mg/mL氧化剂、2.5-3.5mg/mL糖类化合物或其衍生物、0.2-0.3mol/L缓冲液；所述单组份TMB显色液的pH值为3.0-5.0。本专利技术还提供了上述单组份TMB显色液的配制方法。具体技术方案如下：上述单组份TMB显色液的配制方法，包括以下步骤：配制缓冲液，用酸调节pH值，再加入甘油，用水定容，得混合溶液A；将TMB溶解于二甲基亚砜中，再加入到所述混合溶液A中，得混合溶液B；在所述混合溶液B中加入糖类化合物或其衍生物以及氧化剂，充分混匀，即得所述单组份TMB显色液。在其中一些实施例中，用于调节pH值的酸为浓盐酸。本专利技术的单组份TMB显色液具有以下有优点和有益效果：本专利技术的单组份TMB显色液，通过在显色体系中加入糖类化合物或其衍生物作为着附剂，使TMB与HRP显色反应的反应产物能够固定于反应膜或者细
胞原位上，形成与DAB一致的显色斑点，因此能够用于Western、免疫组化(IHC)或原位杂交等实验，解决了传统的TMB显色液不能用于Western、IHC或原位杂交实验的问题。本专利技术的单组份TMB显色液，通过糖类化合物或其衍生物与其它各组分(TMB、二甲基亚砜、甘油、氧化剂、缓冲液)以特定浓度互配，可以实现以混合的单一液体存在，无需分成A液、B液，该单组份TMB显色液可直接使用，操作更为便利，也可降低包装成本，减少了A液、B液在混匀过程中的实验误差和批间质量不均一的问题。本专利技术的单组份TMB显色液，通过糖类化合物或其衍生物与其它各组分(TMB、二甲基亚砜、甘油、氧化剂、缓冲液)以特定浓度互配，使其灵敏度高、稳定性好、保存时间长、灵敏度与稳定性均比DAB显色液强，同时解决了现有的单组份TMB显色液的稳定性问题。附图说明图1为单组分TMB显色液与DAB显色液的灵敏度比较结果示意图；图2为经过不同保存条件保存后的单组分TMB显色液的灵敏度比较结果示意图；图3为本专利技术的单组份TMB显色液与传统单组份TMB显色液的显色效果比较示意图。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术的单组份TMB显色液和配制方法作进一步详细的说明。以下实施例中所用试剂如无特殊说明均为市售普通试剂。实施例1本实施例的单组份TMB显色液由以下方法配制得到：称取25g柠檬酸(0.13mol)与29g二水柠檬酸三钠(0.099mol)，溶于800ml
去离子水中，用浓盐酸调pH至4.0，加入100ml甘油后再定容到1000ml，即得混合溶液A。称取350mg TMB粉末，溶解于5ml二甲基亚砜中，完全溶解后加入到上述混合溶液A中，得到新的混合液B。向上述混合液B中加入3g DEAE葡聚糖盐酸盐与350mg过氧化脲，充分混匀，即得所述单组分TMB显色液，避光4℃保存。实施例2本实施例的单组份TMB显色液由以下方法配制得到：称取120g柠檬酸(0.62mol)与150g乙酸钠(1.83mol)，溶于800ml去离子水中，用浓盐酸调pH至6.0，加入100ml甘油后再定容到1000ml，即得混合溶液A。称取300mg TMB粉末，溶解于5ml二甲基亚砜中，完全溶解后加入到上述混合溶液A中，得到新的混合液B。向上述混合液B中加入3.5g右旋糖酐与350mg过氧化脲，充分混匀，即得所述单组分TMB显色液，避光4℃保存。实施例3TMB显色液与DAB显色液的灵敏度比较用abcam公司的HRP标记羊抗鼠二抗(货号ab6789)做梯度稀释后，取1ul直接在复印纸上划线，待完全吸收干燥后，分别浸泡于上述实施例1所配置的单组分TMB显色液与DAB显色液(广州捷倍斯生物科技有限公司的产品，货号G3433)中，浸泡30分钟后用自来水冲洗终止显色。显色结果如图1所示，A为TMB显色液，B为DAB显色液。从图1可以看出，本专利技术的单组分TMB显色液对1:4500稀释度的HRP标记羊抗鼠二抗能够检出，而DAB显色液对1:2000稀释度的HRP标记羊抗鼠二抗也无法检测，表明本专利技术的单组分TMB显色液具有比DAB显色液更高的灵敏度。实施例4TMB显色液的稳定性用abcam公司的HRP标记羊抗鼠二抗(货号ab6789)做梯度稀释后，取1ul直接在复印纸上划线，待完全吸收干燥后，分别浸泡于经过不同保存条件保存后的单组分TMB显色液中，浸泡30分钟后用自来水冲洗终止显色。其中单组分TMB显色液按照上述实施例1的方法配制。结果如图2所示，C为新鲜配制的单组分TMB显色液；D为室温避光保存1年的单组分TMB显色液。从图2中可以看出，室温避光保存一年的单组分TMB显色液(C)与新鲜配制的单组分TMB显色液(D)对HRP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单组份TMB显色液，其特征在于，包括以下组分：0.1‑2mg/mL TMB、体积分数为0.1‑3％的二甲基亚砜、体积分数为1‑10％的甘油、0.01‑0.5mg/ml氧化剂、0.5‑10mg/mL糖类化合物或其衍生物、0.1‑2.5mol/L缓冲液；所述单组份TMB显色液的pH值为3.0‑7.0；所述缓冲液选自柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸‑EDTA缓冲液、柠檬酸‑乙酸钠缓冲液或柠檬酸‑磷酸氢二钠缓冲液；所述糖类化合物或其衍生物选自糖苷或其衍生物、葡聚糖或其衍生物和聚蔗糖或其衍生物中的至少一种。

【技术特征摘要】
1.一种单组份TMB显色液，其特征在于，包括以下组分：0.1-2mg/mL TMB、体积分数为0.1-3％的二甲基亚砜、体积分数为1-10％的甘油、0.01-0.5mg/ml氧化剂、0.5-10mg/mL糖类化合物或其衍生物、0.1-2.5mol/L缓冲液；所述单组份TMB显色液的pH值为3.0-7.0；所述缓冲液选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-EDTA缓冲液、柠檬酸-乙酸钠缓冲液或柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；所述糖类化合物或其衍生物选自糖苷或其衍生物、葡聚糖或其衍生物和聚蔗糖或其衍生物中的至少一种。2.根据权利要求1所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述糖类化合物或其衍生物选自葡聚糖或其衍生物。3.根据权利要求2所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述葡聚糖或其衍生物选自DEAE葡聚糖盐酸盐或右旋糖酐。4.根据权利要求1所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述缓冲液选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。5.根据权利要求1所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢秀劲，王小芳，
申请(专利权)人：广州捷倍斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44