一种单组份TMB显色液及其制备方法技术

本发明专利技术公开一种单组份TMB显色液，所述单组份TMB显色液包含TMB和L‑甲硫氨酸。本发明专利技术所述单组份TMB显色液添加了L‑甲硫氨酸作为抗氧化剂，可防止TMB的氧化，使本发明专利技术中的TMB能稳定保存24个月，同时，在终止反应后能稳定放置3小时以上，与现有TMB需在终止反应后30min内读数更加方便，更具灵活性。同时，本发明专利技术还公开了所述单组份TMB显色液的制备方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物体外诊断试剂及其制备方法，尤其是一种TMB显色液及其制备方法。
技术介绍
TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)是一种新型安全的色原试剂，作为过氧化物酶的新底物，在酶联免疫吸附检测(ELISA)中获得了广泛应用。底物产生一种可溶性淡蓝色的末端产物，可在370或630nm在分光光度计上读取。其适用于酶联免疫反应中的显色阶段的定量和定性分析。其检验的原理是：当标记在抗体或抗原上的酶与显色液中的TMB、双氧水等反应，加入终止液后溶液由无色变成黄色，黄色深浅反应ELISA体系中抗原抗体结合的多少，从而判断某种抗原或抗体的多少。在通过酶标仪测度吸光值，判断免疫反应的程度。现有市售的酶联免疫试剂盒所采用TMB显色剂液分为两种，一种为双组份，分A液和B液，使用之前需要先混匀，由于在使用上易造成操作不方便，且混合后保存时间短等缺点，逐渐被第二种取代；第二种即为单组份TMB，操作方便，但目前市面上所使用的单组份TMB稳定性差，保存时间短，大部分的保存时间在3-6个月，且显色背景高，均一性不好。TMB为脂溶性化合物，难溶于水，且容易在空气环境中被氧化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种TMB溶解度高、TMB溶液稳定性强、反应终止后结果能稳定保存一段时间、读数更加方便的单组份TMB显色液；同时，本专利技术还提供了所述单组份TMB显色液的制备方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种单组份TMB显色液，包含TMB，所述TMB显色液还包含L-甲硫氨酸。TMB在显色反应中为供氢体，反应中除了在相关酶的催化下进行显色反应，容易被空气或溶液中存在的O2-和OH-氧化。本申请专利技术人在此基础上选择使用抗氧化剂阻止TMB的非酶氧化，在众多的抗氧化剂中，经过大量研究及试验发现，当选择L-甲硫氨酸作为TMB的抗氧化剂，不仅能够防止TMB被O2-和OH-氧化，而且能够提高TMB溶液的稳定性及检测的灵敏度。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述L-甲硫氨酸在TMB显色液中的质量浓度为0.02～1g/L。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的更优选实施方式，所述L-甲硫氨酸在TMB显色液中的质量浓度为0.1～0.3g/L。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述单组份TMB显色液还包含吐温80和羟丙基-β-环糊精。本专利技术的单组份TMB显色液，通过引入吐温-80和羟丙基-β-环糊精助溶TMB，使本专利技术的单组份TMB显色液形成稳定的水溶液体系，同时羟丙基-β-环糊精有1个“内疏水、外亲水”的特殊立体环状结构，能够对脂溶性的TMB进行包合，从而提高TMB分子的水溶性、稳定性和抗氧化、抗光解能力，配合其它组分可使本专利技术在2-8℃下，能保存24个月。同时羟丙基-β-环糊精作为稳定剂，能使TMB显色液在强酸终止反应后，信号稳定时间更长。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述吐温-80在TMB显色液中的质量浓度为1～15g/L；所述羟丙基-β-环糊精在TMB显色液中的质量浓度为2～9g/L。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的更优选实施方式，所述吐温-80在TMB显色液中的质量浓度为4～10g/L；所述羟丙基-β-环糊精在TMB显色液中的质量浓度为2.5～5g/L。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述单组份TMB显色液还包含DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸和过氧化氢；所述DMSO在TMB显色液中的体积浓度为5～40ml/L；所述磷酸氢二钠在TMB显色液中的摩尔浓度为0.05-0.1mol/L；所述柠檬酸在TMB显色液中的摩尔浓度为0.03-0.05mol/L；所述过氧化氢在TMB显色液中的体积浓度为1-1.25ml/L；所述TMB在所述TMB
显色液中的质量浓度为0.1-1g/L。二甲基亚砜(DMSO)是一种含硫有机化合物，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为\万能溶剂\。采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液作为基础溶液，来溶解各物质成分。TMB在过氧化氢的存在下，被氧化成最终产物。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的更优选实施方式，所述DMSO在TMB显色液中的体积浓度为10～20ml/L；所述TMB在所述TMB显色液中的质量浓度为0.1-0.4g/L。本专利技术人经过大量实验研究发现，各物质在此含量范围内，TMB显色液的各项性能达到最优。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述TMB显色液的pH为2.5-4.8。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的更优选实施方式，所述TMB显色液的pH为3.8-4.2。同时，本专利技术还提供一种如上所述单组份TMB显色液的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)配制磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠、柠檬酸溶于去离子水中，用HCl调节pH至2.5～3.0，即得磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；(2)称取吐温-80、羟丙基-β-环糊精和L-甲硫氨酸，边搅拌边将其加入到步骤(1)所得的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，将其溶解直到溶液不再含有微小颗粒；(3)称取TMB，加入DMSO，使之充分溶解；(4)将步骤(3)所得的溶液加入步骤(2)所得的溶液中，充分搅拌，直到溶液不再含有微小颗粒；(5)在步骤(4)所得溶液的上液中加入过氧化氢，边加入边搅拌，使之充分溶解；(6)用稀盐酸调节pH至2.0-4.8，加纯水定容；(7)过滤获得均一的溶液，即为单组份TMB显色液。作为本专利技术所述单组份TMB显色液的制备方法的优选实施方式，所述步骤(6)中用稀盐酸调节pH至3.8～4.2，然后再加纯水定容。本专利技术所述单组份TMB显色液，通过抗氧化剂L-甲硫氨酸的使用，可防止TMB的氧化，使本专利技术中的TMB能稳定保存24个月，同时，在终止反应后能稳定放置3小时以上，与现有TMB需在终止反应后30min内读数更加方便，更具灵活性。本专利技术所述单组份TMB显色液的制备方法，操作方便，能够快速高效制备得到本专利技术的单组份TMB显色液。具体实施方式为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1本专利技术单组份TMB显色液的一种实施例，本实施例所述单组份TMB显色液包含以下成分：TMB、吐温80、羟丙基-β-环糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸、过氧化氢；其中，所述TMB在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.1g/L，所述吐温80在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为4g/L，所述羟丙基-β-环糊精在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为2.5g/L，所述L-甲硫氨酸在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.3g/L，所述DMSO在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为20ml/L，所述磷酸氢二钠在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.1mol/L，所述柠檬酸在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.05mol/L，所述过氧化氢在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为1ml/L。本实施例所述单组份TMB显色液采用以下方法制备而成：(1)配制磷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单组份TMB显色液，包含TMB，其特征在于，所述单组份TMB显色液还包含L‑甲硫氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种单组份TMB显色液，包含TMB，其特征在于，所述单组份TMB显色液还包含L-甲硫氨酸。2.如权利要求1所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述L-甲硫氨酸在TMB显色液中的质量浓度为0.02～1g/L。3.如权利要求2所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述L-甲硫氨酸在TMB显色液中的质量浓度为0.1～0.3g/L。4.如权利要求1～3任一项所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述单组份TMB显色液还包含吐温80和羟丙基-β-环糊精。5.如权利要求4所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述吐温-80在TMB显色液中的质量浓度为1～15g/L；所述羟丙基-β-环糊精在TMB显色液中的质量浓度为2～9g/L。6.如权利要求5所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述吐温-80在TMB显色液中的质量浓度为4～10g/L；所述羟丙基-β-环糊精在TMB显色液中的质量浓度为2.5～5g/L。7.如权利要求1-6任一项所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述TMB显色液还包含DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸和过氧化氢；所述DMSO在TMB显色液中的体积浓度为5～40ml/L；所述磷酸氢二钠在TMB显色液中的摩尔浓度为0.05-0.1mol/L；所述柠檬酸在TMB显色液中的摩尔浓度为0.03-0...

【专利技术属性】
技术研发人员：李民友，张玲，李妙红，蓝媛，齐宗献，
申请(专利权)人：广州市进德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44