一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法技术

一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法，以去壳干制牡蛎为原料，采用酸性胃蛋白酶和碱性胰蛋白酶进行酶解，酶解液通过三硝基苯磺酸（TNBS）法确定最佳酶解时间，利用大孔树脂DA201-C按照疏水性的不同对酶解液进行肽组分分离，从而得到牡蛎源抗炎症肽。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法。
技术介绍
慢性炎症参与人体多种疾病的发生发展，是多种疾病的致病基础。从细菌感染引起的结核性胸膜炎、病毒感染引发的慢性乙肝，到自身免疫性的类风湿性关节炎，以及哮喘、动脉粥样硬化等慢性疾病，都与慢性炎症息息相关。目前，临床上针对炎症的治疗药物主要包括甾体类和非甾体类两种。甾体类药物主要通过稳定溶酶体膜，抑制白细胞游走而产生效果。长期服用甾体类抗炎药可使人体产生激素依赖性，甚至会产生免疫抑制、影响全身代谢的副作用。非甾体类抗炎药主要通过阻断花生四烯酸形成前列腺素而发挥作用，从而对肾及胃肠粘膜具有一定的损伤作用。长期服用抗炎症药物不仅对人体健康产生一定影响，还需要较大的经济投入。因此，以食物为研究对象，制备出一种对人体健康无害，且价格较为合理的抗炎症产品前景广阔。牡蛎是世界第一大养殖贝类，其营养价值极高，具有“海中牛奶“的美誉，是我国首批列为药食同源的保健疗效食品之一。牡蛎的蛋白质含量高达50%，而且还含有大量的氨基酸，糖原，牛磺酸和活性微量元素，药用价值极高。研究表明，牡蛎还具有降血糖，降血脂，抗疲劳，保肝，抗癌，抗氧化，降血压，增强免疫功能，保护血管内皮细胞等强大的生物活性功能。近年来，针对牡蛎酶解液分离制备抗炎症活性肽也正逐步受到学者的关注。生物活性肽在完整蛋白分子中并不显示其生物活性，只有将生物活性肽从蛋白大分子中释放出来方可体现其生物活性功能。目前制备生物活性肽采用较多的方法为酶解法。而对牡蛎的酶解情况，相关研究的水解酶普遍采用的是动物源的酸性胃蛋白酶与碱性胰蛋白酶；同时牡蛎中抗氧化、降血压活性肽的制备也有研究。本专利技术则是以三硝基苯磺酸（TNBS）法对牡蛎的胃蛋白酶和胰蛋白酶的酶解液进行测定从而确定最佳酶解时间。根据文献中关于疏水性活性肽与抗氧化活性肽的关联性，以及活性肽抗氧化水平与其抗炎症能力的关联性，利用大孔树脂DA201-C按照疏水性的不同对酶解液进行肽组分分离。通过测定活性肽的抗氧化能力，推测活性肽组分的抗炎症特性，从而制备一种牡蛎源的抗炎症肽。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法，克服现有药物在抗炎症方面的缺陷以及生物活性肽在制备方面的不足。本专利技术的技术方案为：以去壳干制牡蛎为原料，采用酸性胃蛋白酶和碱性胰蛋白酶进行酶解，酶解液通过三硝基苯磺酸（TNBS）法确定最佳酶解时间，利用大孔树脂DA201-C按照疏水性的不同对酶解液进行肽组分分离，从而得到牡蛎源抗炎症肽。其特征工艺步骤为：（A）去壳干制牡蛎40oC热风干燥，打磨粉碎后过80目标准筛。（B）TNBS法测定水解度：取0.25 mL样品或标准品于用锡箔纸包裹的离心管中；加入2 mL磷酸缓冲液，混匀，于暗室加2 mL TNBS溶液；50oC，90rpm水浴振荡1 h；加入0.1%盐酸4 mL，混匀，冷却至室温，静置30 min；每管取0.3 mL加入96孔板，以去离子水作空白对照，测340 nm吸光值，计算酶解液水解度。（C）大孔树脂吸附层析：(1)大孔树脂预处理95%乙醇对大孔树脂浸泡24 h；无水乙醇对树脂颗粒冲洗数遍后加入到玻璃层析柱中，顶空距离为12 cm；分别以无水乙醇和去离子水洗柱；用3%的盐酸洗柱，待流出液pH约为1时关闭，盐酸浸泡3 h后继续用3%的盐酸洗柱；去离子水洗柱至中性；用3%的氢氧化钠洗柱，待流出液pH达约12时关闭，浸泡3 h后继续以氢氧化钠洗柱；去离子水洗柱至中性；分别用乙醇和去离子水洗柱待用。(2)样品吸附层析分离用pH=2的磷酸缓冲液对柱子酸化；加入适量酶解液样品，吸附约1.5 h；以pH=2的磷酸缓冲液洗柱后对蛋白检测仪进行调零；分别用20%乙醇，40%乙醇和60%乙醇洗脱，并收集洗脱峰；分别以无水乙醇和去离子水洗柱；对收集样品测220 nm吸光值，以无水乙醇为对照。本专利技术的优点是：本专利技术是通过TNBS法测定胃蛋白酶，胰蛋白酶及混合酶解液的水解度，选择4 h作为两种酶的酶解时间；利用大孔树脂DA201-C按照疏水性的不同对酶解液进行肽组分分离，对收集到的样品进行冷冻干燥后可得到胃蛋白酶20%乙醇浓度洗涤样品(PEP-1)、40%乙醇浓度洗涤样品(PEP-2)、胰蛋白酶40%乙醇浓度洗涤样品(TRYP-2)及混合酶40%乙醇浓度洗涤样品四种抗炎症肽（其中胰蛋白酶和混合酶在20%乙醇浓度收集到的样品(TRYP-1，MIX-1)冷冻干燥后呈粘稠状，难分离则弃舍）。附图说明图1为具体实施方案中肽组分细胞毒性的测定结果。PEP-1-1，1 mg/mL的PEP-1； PEP-1-0.6，0.6 mg/mL的PEP-1； PEP-1-0.2，0.2 mg/mL的PEP-1; PEP-2-1，1 mg/mL的PEP-2； PEP-2-0.6，0.6 mg/mL的PEP-2；PEP-2-0.2，0.2 mg/mL的PEP-2; TRYP-2-1，1 mg/mL的TRYP-2; TRYP-2-0.6，0.6 mg/mL的TRYP-2; TRYP-2-0.2，0.2 mg/mL的TRYP-2； MIX-2-1，1 mg/mL的MIX-2； MIX-2-0.6，0.6 mg/mL的MIX-2； MIX-2-0.2，0.2 mg/mL的MIX-2.图2 为具体实施方案中肽组分对细胞因子TNF-α的影响。PEP-1-0.6，0.6 mg/mL的PEP-1； PEP-1-0.2，0.2 mg/mL的PEP-1; PEP-2-0.6，0.6 mg/mL的PEP-2；PEP-2-0.2，0.2 mg/mL的PEP-2; TRYP-2-0.6，0.6 mg/mL的TRYP-2; TRYP-2-0.2，0.2 mg/mL的TRYP-2； MIX-2-0.6，0.6 mg/mL的MIX-2； MIX-2-0.2，0.2 mg/mL的MIX-2.图3为具体实施方案中肽组分对细胞因子TGF-β1的影响。PEP-1-0.6，0.6 mg/mL的PEP-1；PEP-2-0.6，0.6 mg/mL的PEP-2；TRYP-2-0.2，0.2 mg/mL的TRYP-2；MIX-2-0.2，0.2 mg/mL的MIX-2.具体实施方式实施例：细胞毒性与抗炎症实验（1）巨噬细胞毒性测定(a)溶液配制及样品准备分别对四种肽组分样品配制三个浓度：1 mg/mL，0.6 mg/mL和0.2 mg/mL。(b)取96孔板，加入100 μL完全培养液，按表1所示进行加样后密封，培养24 h；样品组、对照组、空白组分别加入10 μL不同样品和磷酸缓冲液，孵育24 h后，向培养基中加入10 μL的Cell Counting Kit(CCK试剂盒)溶液；孵育4 h后测450 nm波长下的吸光值，并计算细胞活力。表1 细胞毒性测试设置表1 细胞毒性测试设置细胞药CCK样品组有有有对照组有无有空白组无有有(2)抗炎实验样品制备将PEP-1，PEP-2，TRYP-2，MIX-2四种肽组分配制成浓度为6 mg/mL，2 mg/mL的样品；在24孔板加入0.6 mL细胞培养液后置于CO2细胞培养箱中培养24 h，移去细胞培养液后再加入0.6 mL细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法，以去壳干制牡蛎为原料，采用酸性胃蛋白酶和碱性胰蛋白酶进行酶解，酶解液通过三硝基苯磺酸（TNBS）法确定最佳酶解时间，利用大孔树脂DA201‑C按照疏水性的不同对酶解液进行肽组分分离，从而得到牡蛎源抗炎症肽；其特征在于：去壳干制牡蛎热风干燥，打磨粉碎后过标准筛、用TNBS法测定水解度、大孔树脂吸附层析分离、将层析收集到的样品进行冷冻干燥后可得到四种抗炎症肽。

【技术特征摘要】
1.一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法，以去壳干制牡蛎为原料，采用酸性胃蛋白酶和碱性胰蛋白酶进行酶解，酶解液通过三硝基苯磺酸（TNBS）法确定最佳酶解时间，利用大孔树脂DA201-C按照疏水性的不同对酶解液进行肽组分分离，从而得到牡蛎源抗炎症肽；其特征在于：去壳干制牡蛎热风干燥，打磨粉碎后过标准筛、用TNBS法测定水解度、大孔树脂吸附层析分离、将层析收集到的样品进行冷冻干燥后可得到四种抗炎症肽。2.根据权利要求1所述的一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法，其特征在于：去壳干制牡蛎30～50oC热风干燥，打磨粉碎后过60～200目标准筛。3.根据权利要求1所述的一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法，其特征在于：TNBS法测定水解度：取0.25 mL样品或标准品于用锡箔纸包裹的离心管中；加入2 mL磷酸缓冲液，混匀，于暗室加2 mL TNBS溶液；40～60oC，60～120rpm水浴振荡0.5～2 h；加入0.1%盐酸4 mL，混匀，冷却至室温，静置10～60 min；每管取0.3 mL加入96孔板，以去离子水作空白对照，测340 nm吸光值，计算酶解液水解度，确定两种酶的酶解时间为4h。4.根据权利要求1所述的一种牡蛎源抗炎症肽的制备方法，其特征在于：大孔树脂吸附层析，其中大孔树脂预...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱炳俊，敬璞，刘小兵，麦文镇，
申请(专利权)人：海南椰岛集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：海南;46