一种幽门螺杆菌基因无痕敲除的方法技术

本发明专利技术涉及微生物基因工程领域中的基因敲除技术，特别涉及一种幽门螺杆菌基因无痕敲除的方法，（a）构建适用于幽门螺杆菌的敲除模板质粒和辅助质粒；（b）设计目的基因同源重组双交换同源臂，在敲除模板质粒基础上构建目的基因敲除质粒，转入幽门螺杆菌中得到基因敲除突变株；（c）将辅助质粒转入上步骤得到的基因敲除突变株中，去除抗性基因，得到携带辅助质粒的无痕基因敲除突变株；（d）辅助质粒通过无抗生素传代培养消除，最终获得无痕基因敲除突变株。本发明专利技术，实现了幽门螺杆菌中无痕基因敲除突变株的构建，相比普通的基因敲除，该方法在实现目的基因敲除的同时不引入外源基因，使对目的基因的功能分析更为准确。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物基因工程领域中的基因敲除技术，特别涉及一种幽门螺杆菌基因无痕敲除的方法。
技术介绍
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H. pylori）是感染胃部的最常见的病原性细菌，幽门螺杆菌感染是慢性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡等胃肠道疾病发生的重要病因，并与胃癌、胃粘膜相关淋巴样组织（MALT）淋巴瘤的发生密切相关。幽门螺杆菌的全世界感染率为50%-80%，高发地区集中在东亚，包括中国、日本和韩国。我国是胃癌发病率和病死率较高的地区，每年全球新发100余万胃癌患者中，我国占42%，约80万死亡胃癌患者中，我国占35%，发病率和病死率均超过世界平均水平两倍多。目前一般认为，幽门螺杆菌通过黏附定植于胃黏膜，释放毒力因子，与宿主细胞相互作用产生一系列炎症反应，最终导致慢性炎症、溃疡、癌症等临床结果。多种致病因子参于了幽门螺杆菌的致病过程，对致病因子的深入研究大大促进了我们对幽门螺杆菌致病机制的了解。然而迄今为止，幽门螺杆菌的致病机理仍不完全明确，而幽门螺杆菌感染导致的多样化感染结局更不清楚。一些潜在的致病因子或功能基因仍有待于进一步发掘来不断完善对幽门螺杆菌致病机制的认识。基因操作是研究基因功能最直接和最有效的技术手段，经过多年技术积累，幽门螺杆菌的基因操作技术得到深入发展。转座子插入突变技术被应用在幽门螺杆菌致病因子的早期研究中。由于转座子插入突变具有随机性和极性效应的劣势，逐渐被基于同源重组的基因敲除方法所取代。幽门螺杆菌中大量致病因子的功能借助同源重组基因敲除的方法得以阐明。
技术实现思路
本专利技术构建了一种幽门螺杆菌基因无痕敲除的方法，与普通的同源重组基因敲除方法相比，在实现目的基因敲除的同时不引入外源基因，使得对目的基因的功能分析更为准确。本专利技术一种幽门螺杆菌基因无痕敲除的方法，包括如下步骤：（a）构建适用于幽门螺杆菌的带有FRT位点的卡那霉素抗性敲除模板质粒和表达FLP重组酶的氯霉素抗性辅助质粒；（b）设计目的基因同源重组双交换同源臂，在敲除模板质粒基础上构建目的基因敲除质粒，转入幽门螺杆菌中得到带有FRT位点和卡那霉素抗性的基因敲除突变株；（c）将表达FLP重组酶的氯霉素抗性辅助质粒转入上步骤得到的基因敲除突变株中，去除FRT位点之间的卡那霉素抗性基因，得到携带辅助质粒的无痕基因敲除突变株；（d）辅助质粒通过无抗生素传代培养消除，最终获得无痕基因敲除突变株。本专利技术，实现了幽门螺杆菌中无痕基因敲除突变株的构建，相比普通的基因敲除，该方法在实现目的基因敲除的同时不引入外源基因，使对目的基因的功能分析更为准确。此方法不仅可以用于幽门螺杆菌的基因敲除，而且可以用于适用此基因敲除原理的其它微生物基因敲除的构建。附图说明图1：pTSKHP质粒图；图2：pCHFHP质粒图；图3：pTSKHP-0788质粒图；图4：hp0788无痕基因敲除步骤。具体实施方式实施例一一般性说明PCR反应使用的DNA聚合酶是北京全式金生物技术有限公司的高保真PfuDNA聚合酶。质粒构建过程中酶切连接使用的各种限制性内切酶为Fermentas公司产品，T4DNA连接酶使用的是Takala公司产品。用于连接产物转化的大肠杆菌DH5α感受态购自北京全式金生物技术有限公司。细菌基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒均购自天根生化科技有限公司。结合图1至图4，做如下具体说明：1、在幽门螺杆菌中构建FLP-FRT重组系统原件（1）包含FRT位点的同源重组双交换敲除模板质粒的构建在实验室构建的同源重组双交换敲除模板质粒pSJHK的基础上，构建包含FRT位点的敲除模板质粒。以pKD3为模板，以FRT-1（CTTAGAGCTCATCAAGTCGACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG）和FRT-2（CGGAGGTACCGAATTAGCCATGGTCCATATG）为引物扩增包含FRT的基因片段，得到的基因片段经SacI和KpnI酶切后连入实验室构建的同源重组双交换敲除模板质粒pSJHK中，得到pSJHK-FRT。利用引物BssHII-KmF（CTAGCTGCGCGCTGCCGCAAGCACTCA）和BssHII-KmR（GCCTTCGCGCGCGATACCCCTCGAATTGA）以pSJHK为模板扩增卡那霉素抗性基因（aphA），经BssHII酶切后重新连入pSJHK-FRT质粒中，得到包含FRT位点的同源重组双交换敲除模板质粒pTSKHP。图1显示质粒pSJHK-FRT的模式图，在卡那霉素抗性基因的两端分别有一个FRT位点，再向外是两组多克隆位点，用于连入同源重组双交换的同源臂。（2）幽门螺杆菌中FLP重组酶表达质粒的构建利用在Cytophaga hutchinsonii中表达FLP重组酶的质粒pCHF为模板构建用于幽门螺杆菌中FLP重组酶的表达质粒pCHFHP。以幽门螺杆菌中的内源质粒pHel1作为复制起始子，以pHel1-1（CTTGATGAGCTCGAAGCTTGTCCGTTAG）和pHel1-2（CGTCTTGGTCGACTAGAAAGGGAAATG）为引物扩增pHel1质粒序列，得到的扩增片段经SacI和SalI酶切后连入到质粒pCHF上的相应位点，构建质粒pCHF-p。氯霉素抗性基因（cat-GC）以cm-1（TCCGATGTCGACCCGGTTTTTGTTAATCC）和cm-2（CACCAGGCATGCGTAACTCCTTCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATC）为引物，以质粒pTnMax9为模板扩增，得到的扩增片段经SalI和SphI酶切后连入到质粒pCHF-p上的相应位点，构建质粒pCHFHP，如图2所示。2、利用FLP-FRT重组系统实现幽门螺杆菌中基因无痕敲除以基因hp0788为例说明利用FLP-FRT重组系统实现幽门螺杆菌中基因无痕敲除的步骤（图4）。hp0788含有1500个核苷酸，有研究报道发现hp0788对于H. pylori在胃中的定植是不可缺少的，生物信息学分析预测hp0788编码一个外膜蛋白（HP0788，499个氨基酸）。对于这个外膜蛋白的功能研究目前还不清楚，推测它可能作为一个粘附因子，类似于其他已知的粘附因子（AlpAB，BabA，HopZ）在H. pylori的定植中发挥粘附作用；也可能作为一个表面蛋白，在菌体与胃黏液相互作用中起到稳定细胞外膜、保护菌体的作用。本研究中获得的hp0788基因敲除突变株为深入研究hp0788基因功能提供了前提，而该基因功能的阐明有助于进一步分析H. pylori的致病机制，同时可能作为疫苗开发的潜在靶位点。（1）同源重组双交换敲除质粒pTSKHP-0788的构建根据hp0788基因上下游核苷酸序列及引物设计原则设计并合成如下引物：0788-1：GAACGGTGGATCCGAACAGGCGTAAAGAAATCG；0788-2：TAAGCCAGGTACCTCATAAAGGTTTCGGTAGG；0788-3：TAGACGGTCGACCCGCCACCGATCAAGACA；0788-4：GGACTGGAGCTCTATTAACCAAAGCCACAAAGAC；以幽门螺杆菌基因组DNA为模板，利用上述引物0788-1/0788-2进行PCR扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种幽门螺杆菌基因无痕敲除的方法，包括以下步骤：（a）构建适用于幽门螺杆菌的带有FRT位点的卡那霉素抗性敲除模板质粒和表达FLP重组酶的氯霉素抗性辅助质粒；（b）设计目的基因同源重组双交换同源臂，在敲除模板质粒基础上构建目的基因敲除质粒，转入幽门螺杆菌中得到带有FRT位点和卡那霉素抗性的基因敲除突变株；（c）将表达FLP重组酶的氯霉素抗性辅助质粒转入上步骤得到的基因敲除突变株中，去除FRT位点之间的卡那霉素抗性基因，得到携带辅助质粒的无痕基因敲除突变株；（d）辅助质粒通过无抗生素传代培养消除，最终获得无痕基因敲除突变株。

【技术特征摘要】
1.一种幽门螺杆菌基因无痕敲除的方法，包括以下步骤：（a）构建适用于幽门螺杆菌的带有FRT位点的卡那霉素抗性敲除模板质粒和表达FLP重组酶的氯霉素抗性辅助质粒；（b）设计目的基因同源重组双交换同源臂，在敲除模板质粒基础上构建目的基因敲除质粒，转入幽门螺杆菌中得到带...

【专利技术属性】
技术研发人员：季晓飞，赵慧琳，李波清，张莹，王颖，
申请(专利权)人：滨州医学院，
类型：发明
国别省市：山东;37