本发明专利技术公开了一种用于预防猪弓形虫病的重组卡介苗，本发明专利技术还提供了该疫苗的制备方法；利用卡介苗活载体疫苗本身具有较强的细胞免疫和体液免疫佐剂作用的特点，而且能高效表达外源蛋白，使表达的蛋白发挥很好的免疫保护作用，两者优势组合，达到更好的预防弓形虫病的目的。重组BCG集佐剂和载体于一身、兼多种外源基因与活疫苗于一体，一次接种，可获得强而持久的特异性免疫。而且重组BCG稳定且安全性高，运输和保存较为容易。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于疫苗
，公开了一种用于预防猪弓形虫病的重组卡介苗，本专利技术还提供了该疫苗的制备方法。
技术介绍
弓形虫为世界性分布的专性细胞内寄生原虫，可入侵多种动物（如：猪、牛、羊等）和人的有核细胞，导致弓形虫感染或弓形虫病。动物感染弓形虫后易引起动物生长、生产性能下降，免疫力降低，繁殖力下降，严重者造成动物死亡。猪感染弓形虫病后可引起大批死亡，怀孕母畜感染弓形虫病后导致流产。由于弓形虫生活史复杂，传播途径多样，对弓形虫病的预防和控制尚未有理想的药物。因此，研制安全、有效、廉价的弓形虫疫苗对于防治弓形虫病有重要意义。弓形虫病疫苗的研究从最早的全虫疫苗发展到核酸疫苗，由于弓形虫生活史复杂，传播途径多样等特点，各种疫苗的免疫效果不理想。因此，在弓形虫疫苗的研究工作中，应着重于对弓形虫保护性抗原的深入研究。Rhomboid蛋白是一类膜内丝氨酸蛋白酶，它是参与EGF和EGFR信号转导过程的调节器。近年来，研究者们在许多原核和真核生物体内都发现了该蛋白，在寄生虫领域，恶性疟原虫、柔嫩艾美尔球虫、微小隐孢子虫和弓形虫中均发现了该蛋白。研究证实Rhomboid蛋白在顶器门原虫侵入宿主细胞过程中发挥重要的作用。因此，本研究使用Rhomboid基因作为保护性抗原基因进行重组卡介苗的构建。白细胞介素2 ( interleukine-2, IL-2) 主要是由T淋巴细胞或T淋巴细胞系产生的一类重要的淋巴因子，可作用于多种效应细胞，包括T、B淋巴细胞、巨噬细胞和NK细胞，对免疫应答具有广泛的上调作用。IL-2是目前研究较多的细胞因子佐剂，其良好的免疫增强作用在一些基因疫苗的研究中均得到了证实。卡介苗是目前唯一用于预防结核病的疫苗，在世界卫生组织全球性扩展免疫计划中正广泛使用。卡介苗具有接种安全、热稳定性好、显著的佐剂效应等特点。近年来，BCG已被作为载体大量用于表达外源性蛋白，且均可诱导特异性免疫应答。以BCG为载体的重组疫苗研发日益受到国内外研究学者的关注和重视，针对的病原体涉及病毒、细菌、寄生虫、肿瘤等。有研究表明弓形虫的ROP2（棒状体分泌蛋白）、GRA（颗粒分泌抗原）、Rhomboid蛋白都可以在rBCG中表达并诱导机体的免疫反应，因此，将BCG作为载体表达弓形虫蛋白的rBCG的研制为弓形虫疫苗的发展提供了一个新的思路，也为弓形虫病的预防提供了新的手段，具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于预防猪弓形虫病的重组卡介苗。卡介苗由于其较好的免疫效果，以及毒副作用小、安全性高等特点被广泛的应用。构建的重组卡介苗热稳定性强，适用于工业化生产。本专利技术还公开了用于猪弓形虫病预防的重组卡介苗的制备方法。本专利技术公开了一种用于预防猪弓形虫病的重组卡介苗，其技术解决方案如下：一、穿梭表达载体用于猪弓形虫病预防的重组卡介苗的制备：1、根据NCBI上公布的弓形虫Rhomboid基因(Genbank:AY587210)和猪IL-2基因(Genbank:X58428)的序列及穿梭载体pMV261载体图谱，分别设计引物：猪白介素2(IL-2)上游引物IL-F：5'CGGAATTCATGTATAAGATGCAGCTC 3'，其中5’端的酶切位点为EcoRI。下游引物IL-R：5'CGCGGATCCAGTCAGTGTTGAGTAGATGCTTTG3'，其中5’端的酶切位点为BamHI。弓形虫Rhomboid基因上游引物为R-F: 5'CGCGGATCCATGCCTATTCGCTTTCTCG 3'，其中5’端的酶切位点为BamHI。下游引物R-R: 5' CCCAAGCTTAATGTAGGACAAATCCCTGTGG 3'，其中5’端的酶切位点为HindIII。2、PCR分别扩增弓形虫Rhomboid基因及猪IL-2基因，PCR回收后连入T载体，转入大肠杆菌DH5α感受态中，测序分析鉴定正确后，用于后续试验。分别对测序正确的质粒pMD18-T-Rho、pMD18-T-IL2和pMV261进行双酶切，分别回收两个目的片段和载体大片段，将回收的pMV261、IL2及Rhomboid按照1:3:3的比例进行16℃过夜连接，次日转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，培养菌液后提取质粒（参照试剂盒说明书），分别对重组质粒进行双酶切和PCR鉴定，重组质粒命名为pMV261-IL2-Rho。3、将重组质粒pMV261-IL2-Rho电穿孔转化卡介苗中，kan+抗性筛选阳性菌落，并进行传代培养。45℃热诱导目的蛋白表达，对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及免疫印迹鉴定，命名为rBCG pMV261-IL2-Rho。4、疫苗免疫效果检测：将制备好的重组卡介苗pMV261-IL2-Rho以108CFU/只的剂量通过颈部肌肉注射途径免疫猪，并同时设BCG组和空白对照组，三免后二周腹腔注射的方式接种弓形虫China I株速殖子进行攻虫试验，通过检测体温变化，存活率，体液免疫水平，细胞因子水平和卡介苗残留等指标进行综合评价。用于猪弓形虫病预防的pMV261-IL2-Rho疫苗可对抗一定剂量刚地弓形虫对猪的攻击，特异性抗体滴度随免疫次数增加而逐渐升高，且与对照组相比差异极显著（P<0.01）；IL-2、IFN-γ和IL-12细胞因子浓度均明显升高，且与对照组差异显著（P＜0.05），具有较好的抗弓形虫效果。二、整合表达载体用于猪弓形虫病预防的重组卡介苗的制备：1、根据NCBI上公布的弓形虫Rhomboid基因(Genbank:AY587210)和猪IL-2基因(Genbank:X58428)的序列及整合载体pMV361载体图谱，分别设计引物：猪白介素2(IL-2)引物：IL-F：5'CGGAATTCATGTATAAGATGCAGCTC 3'，其中5’端的酶切位点为EcoRI。IL-R：5'CGCGGATCCAGTCAGTGTTGAGTAGATGCTTTG3'，其中5’端的酶切位点为BamHI。弓形虫Rhomboid引物：R-F: 5'CGCGGATCCATGCCTATTCGCTTTCTCG 3'，其中5’端的酶切位点为BamHI。R-R: 5' CCCAAGCTTAATGTAGGACAAATCCCTGTGG 3'，其中5’端的酶切位点为HindIII。2、PCR分别扩增弓形虫Rhomboid基因及猪IL-2基因，PCR回收后连入T载体，转入大肠杆菌DH5α感受态中，测序分析鉴定正确后，用于后续试验。分别对测序正确的质粒pMD18-T-Rho、pMD18-T-IL2和pMV361进行双酶切，分别回收两个目的片段和载体大片段，将回收的pMV361、IL2及Rhomboid按照1:3:3的比例进行16℃过夜连接，次日转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，培养菌液后提取质粒（参照试剂盒说明书），分别对重组质粒进行双酶切和PCR鉴定，重组质粒命名为pMV361-IL2-Rho。3、将重组质粒pMV361-IL2-Rho电穿孔转化卡介苗中，kan+抗性筛选阳性菌落，并进行传代培养。45℃热诱导目的蛋白表达，对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及免疫印迹鉴定，命名为rBCG pMV361-IL2-Rho。4、疫苗免疫效果检测：将制备好的重组卡介苗pM本文档来自技高网...
【技术保护点】
穿梭表达载体用于猪弓形虫病预防的重组卡介苗的制备方法，包括以下步骤：根据NCBI上公布的弓形虫Rhomboid基因(Genbank:AY587210)和猪IL‑2基因(Genbank:X58428)的序列及穿梭载体pMV261载体图谱，分别设计引物：猪白介素2(IL‑2)上游引物IL‑F：5'CGGAATTCATGTATAAGATGCAGCTC 3'，其中5’端的酶切位点为EcoRI；下游引物IL‑R：5'CGCGGATCCAGTCAGTGTTGAGTAGATGCTTTG3'，其中5’端的酶切位点为BamHI；弓形虫Rhomboid基因上游引物R‑F: 5'CGCGGATCCATGCCTATTCGCTTTCTCG 3'，其中5’端的酶切位点为BamHI；下游引物R‑R: 5' CCCAAGCTTAATGTAGGACAAATCCCTGTGG 3'，其中5’端的酶切位点为HindIII；PCR分别扩增弓形虫Rhomboid基因及猪IL‑2基因，PCR回收后连入T载体，转入大肠杆菌DH5α感受态中，分别对测序正确的质粒pMD18‑T‑Rho、pMD18‑T‑IL2和pMV261进行双酶切，分别回收两个目的片段和载体片段，将回收的pMV261、IL2及Rhomboid按照1:3:3的比例进行16℃过夜连接，次日转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，培养菌液后提取质粒，分别对重组质粒进行双酶切和PCR鉴定，重组质粒命名为pMV261‑IL2‑Rho；将重组质粒pMV261‑IL2‑Rho电穿孔转化卡介苗中，kan+抗性筛选阳性菌落，并进行传代培养；45℃热诱导目的蛋白表达，对表达产物进行SDS‑PAGE电泳分析及免疫印迹鉴定，命名为rBCG pMV261‑IL2‑Rho。...
【技术特征摘要】
1.穿梭表达载体用于猪弓形虫病预防的重组卡介苗的制备方法，包括以下步骤：根据NCBI上公布的弓形虫Rhomboid基因(Genbank:AY587210)和猪IL-2基因(Genbank:X58428)的序列及穿梭载体pMV261载体图谱，分别设计引物：猪白介素2(IL-2)上游引物IL-F：5'CGGAATTCATGTATAAGATGCAGCTC 3'，其中5’端的酶切位点为EcoRI；下游引物IL-R：5'CGCGGATCCAGTCAGTGTTGAGTAGATGCTTTG3'，其中5’端的酶切位点为BamHI；弓形虫Rhomboid基因上游引物R-F: 5'CGCGGATCCATGCCTATTCGCTTTCTCG 3'，其中5’端的酶切位点为BamHI；下游引物R-R: 5' CCCAAGCTTAATGTAGGACAAATCCCTGTGG 3'，其中5’端的酶切位点为HindIII；PCR分别扩增弓形虫Rhomboid基因及猪IL-2基因，PCR回收后连入T载体，转入大肠杆菌DH5α感受态中，分别对测序正确的质粒pMD18-T-Rho、pMD18-T-IL2和pMV261进行双酶切，分别回收两个目的片段和载体片段，将回收的pMV261、IL2及Rhomboid按照1:3:3的比例进行16℃过夜连接，次日转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，培养菌液后提取质粒，分别对重组质粒进行双酶切和PCR鉴定，重组质粒命名为pMV261-IL2-Rho；将重组质粒pMV261-IL2-Rho电穿孔转化卡介苗中，kan+抗性筛选阳性菌落，并进行传代培养；45℃热诱导目的蛋白表达，对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及免疫印迹鉴定，命名为rBCG pMV261-IL2-Rho。...
【专利技术属性】
技术研发人员：宫鹏涛，张西臣，信彩岩，于晓娜，李建华，王伟荣，李显赫，杨举，李赫，李棕松，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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