诱变后高产淀粉酶菌株的筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种诱变后高产淀粉酶菌株的筛选方法，其中包括：诱变后的菌株筛选步骤，将经过诱变处理的第一代菌株进行筛选步骤，包括初筛子步骤及复筛子步骤，其中复筛子步骤的进行同初筛方式的筛选，得到第二代诱变的出发菌株，再次进行诱变及筛选步骤，第二代、第三代至第n代的筛选方法同第一代，至选育出符合要求的高产淀粉菌株。采用了该发明专利技术中的诱变后高产淀粉酶菌株的筛选方法，诱变处理后的出发菌株通过再一次的初筛与复筛可以得到第二代的出发菌株，筛选过程简便易操作，可以在短时间内得到高产淀粉酶菌株，整个筛选过程投资小靶向高，可以定向地得到高酶活的淀粉酶菌株，具有大规模的推广价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物学领域，尤其涉及菌株筛选方法，具体是指一种诱变后高产淀粉酶菌株的筛选方法。
技术介绍
淀粉酶是指能够水解淀粉、糖原和有关多糖中的O-葡萄糖键的酶。一般情况下指做用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1，4-葡聚糖且水解α-1，4-糖苷键的酶。淀粉酶根据作用方式可分为两种：α-淀粉酶(EC3.2.1.1.)与β-淀粉酶(EC3.2.1.2.)。α-淀粉酶广泛分布于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽、山萮菜)及微生物。其中微生物的酶大多都是分泌性的。淀粉酶以Ca2+为其必需因子和作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，同功能的切断α-1，4-链。因此，其反应具有明显现象：为底物溶液粘度的快速下降和碘反应消失。我国是一个农业大国，淀粉资源非常丰富，淀粉酶应用范围广泛，但是我国的淀粉酶生产状况却不容乐观。从自然界中筛选高产淀粉酶菌株是解决这个难题的关键，这种方法的有力之处在于实施起来方便简单，资本投入较小。但它的缺点就在于随机性很大，很多时候不能筛选出理想的菌体。平板菌落透明圈法是现有筛选经诱变后高产淀粉酶菌株的常规方法，但透明圈直径/菌落直径与其摇瓶酶活的相关度特异性较差，而且这个方法也费时费力。因此，探索一种可实现简便筛选经诱变后的高产淀粉酶菌株的方法十分必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服了上述现有技术的缺点，提供了一种能够快速诱变后高产淀粉酶菌株的筛选方法。为了实现上述目的，本专利技术的诱变后高产淀粉酶菌株的筛选方法具有如下构成：该诱变后高产淀粉酶菌株的筛选方法，其主要特点是，所述的筛选方法包括下述步骤：诱变后的菌株筛选步骤：将经过诱变处理的第一代菌株进行筛选步骤，包括初筛子步骤及复筛子步骤，其中：(1)初筛子步骤包括：将直径3～6mm的圆滤纸片放置在淀粉琼脂平皿上，每平皿4～8个，分别吸取等量培养液点到滤纸片上，65℃干燥2h，用碘液检测并比较透明圈的直径，挑选透明圈直径大的30～50株进行复筛；(2)复筛子步骤包括：将30～50株初筛菌株，每种菌株3～5瓶，再次进行同(1.1)初筛方式的筛选，取3～5株作为第二代诱变的出发菌株，再次进行诱变及筛选步骤，第二代、第三代至第n代的筛选方法同第一代，至选育出高产淀粉菌株。优选地，所述的诱变后的菌株来自于下述步骤：(a)第一代出发菌株的筛选步骤：包括初筛步骤及复筛步骤，其中初筛步骤为碘染法，挑出滴加碘液产生透明圈的菌落进行复筛步骤，所述的复筛步骤为曲利苯蓝显色法，挑出产生透明圈的菌落；(b)第一代出发菌株的诱变步骤：通过所述的曲利苯蓝显色法挑选出的产生透明圈的菌落进行诱变处理；更优选地，所述的(a)第一代出发菌的筛选步骤具体包括下述子步骤：(a-a)称取样品0.5g并编号，用无菌水充分稀释溶解，然后取等量转接至200mL富集液体培养基，于37℃培养箱中100～200r/min培养；(a-b)24h后，用无菌水对各样品进行10倍梯度稀释，吸取浓度为10-6的培养液100μL均匀涂布于筛选平板上，于37℃培养箱中培养45～50h；(a-c)加入碘液，观察标出有明显水解圈的菌落,从中选取染色圈直径与菌落直径比值大的单菌落编号并保存；(a-d)将挑选出的单菌落37℃培养箱中100～200r/min培养24h，依次进行102倍、103倍、104倍稀释，分别取10～100μL涂平板，37℃培养24小时，加入曲利苯蓝，观察测量透明圈大小，从中选取染色圈直径与菌落直径比值最大的单菌落编号并保存。进一步地，所述的样品取自土壤中，具体为：采用五点法采集土壤样本，选取2m×2m的样方进行对角线连线，在对角线中心样点处及与中心样点距离相等的四个点作为样点取样。更近一步地，所述的样品取回后进行初筛前还包括富集培养过程，所述的富集培养过程采用碘染法。进一步优选地，所述的(1)初筛子步骤具体包括：将每菌株1～2瓶菌液分别在摇床以100～200r/min培养50h，将直径4mm的圆滤纸片放置在淀粉琼脂平皿上，每平皿6个，分别吸取等量培养液点到滤纸片上，65℃干燥2h，用碘液检测并比较透明圈的直径，挑选透明圈直径大的30～50株进行复筛。更近一步地，所述的淀粉琼脂平皿为1.8％淀粉，1.4％琼脂，2毫米厚度的淀粉琼脂平皿。更进一步优选地，所述的诱变后筛选高产菌株步骤还包括处理子步骤，具体为：将进行过诱变的菌株分离到平皿上，打琼脂块菌落1000～3000块，检定板上挑取5％～10％透明圈的菌落，用于进行(1)初筛子步骤。最优选地，所述的菌落培养使用的固体培养基均为在40～50℃下无菌操作倒出的无菌培养基。采用了该专利技术中的诱变后高产淀粉酶菌株的筛选方法，其技术效果在于，样本初筛时采用碘染法可以快速大量的筛选出需要的菌株，且筛选成本低，在复筛时采用曲利笨蓝显色法，利用曲利苯蓝的特性，不仅可以筛选出产生透明圈的菌落，且其本身对微生物的生长没有抑制作用，可以准确筛选并不对目标菌落造成伤害。诱变处理后的出发菌株通过再一次的初筛与复筛可以得到第二代的出发菌株，筛选过程简便易操作，在酶活性最高的时间段进行可以在短时间内得到复合生产要求的高产淀粉酶菌株，整个筛选过程投资小靶向高，可以定向地得到高酶活的淀粉酶菌株，具有大规模的推广价值。具体实施方式为了能够更清楚地描述本专利技术的
技术实现思路
，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。本专利技术中的诱变后高产淀粉酶菌株的筛选方法有如下优选的具体实施例，其中未做限制与描述的操作步骤以现行的微生物常规操作为准。实施例1:1土壤采样应用五点采样法采集样本。在目的地选取具有代表性的土壤，选取面积为2m×2m。首先把对角线的中点作为中心抽样点，然后在对角线上选择四个与中心样点距离0.5m的点作为样点。2菌种初筛与复筛用碘染法对采样土壤中的菌落进行富集培养和初步筛选。淀粉酶产生菌可以产生淀粉酶排出体外，在菌落周围分解淀粉。而碘液遇淀粉显蓝色。当所筛菌落是淀粉酶产生菌时，周围淀粉被分解，滴加碘液不显色，这样就会在菌落周围产生明显的透明圈。步骤：(1)分别称取各样品0.5g并编号，用无菌水充分稀释溶解，然后取等量转接至200mL
富集液体培养基，于37(±0.5)℃培养箱中150r/min培养；(2)24h后，用无菌水对各样品进行10倍梯度稀释，吸取浓度为10-6的培养液100μL均匀涂布于筛选平板上，于37(±0.5)℃培养箱中培养48h；(3)加入碘液，观察标出有明显水解圈的菌落,从中选取染色圈直径与菌落直径比值大的150个单菌落编号并保存。复筛采用曲利笨蓝显色法。在筛选淀粉酶产生菌时，用碘液染色很直观，但是碘液具有杀菌作用，水解圈出来了，菌也可能被杀死，对实验产生影响。曲利苯蓝对微生物生长没有明显的抑制作用，从这一点来说胜过了用碘液筛菌。曲利苯蓝是一种非特异性染料，也叫锥虫蓝。曲利苯蓝和淀粉由于静电非特异性吸附结合后使淀粉呈稳定的蓝色，当淀粉被淀粉酶水解后因分子变小吸附力减弱，而让曲利苯蓝游离出来，游离的曲利苯蓝被周围未水解的淀粉吸附而使颜色加深，淀粉水解区则形成无色、透明的水解圈。步骤：(1)取已灭菌的固体培养基、培养皿，将培养基溶解，待温度降到45℃则在无菌操作台倒平板；(2)挑选出的单菌落37(±0.5)℃培养箱中150r/m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱变后高产淀粉酶菌株的筛选方法，其特征在于，所述的筛选方法包括下述步骤：诱变后的菌株筛选步骤：将经过诱变处理的第一代菌株进行筛选步骤，包括初筛子步骤及复筛子步骤，其中：(1)初筛子步骤包括：将直径3～6mm的圆滤纸片放置在淀粉琼脂平皿上，每平皿4～8个，分别吸取等量培养液点到滤纸片上，65℃干燥2h，用碘液检测并比较透明圈的直径，挑选透明圈直径大的30～50株进行复筛；(2)复筛子步骤包括：将30～50株初筛菌株，每种菌株3～5瓶，再次进行同(1)初筛方式的筛选，取3～5株作为第二代诱变的出发菌株，再次进行诱变及筛选步骤，第二代、第三代至第n代的筛选方法同第一代，至选育出高产淀粉菌株。

【技术特征摘要】
1.一种诱变后高产淀粉酶菌株的筛选方法，其特征在于，所述的筛选方法包括下述步骤：诱变后的菌株筛选步骤：将经过诱变处理的第一代菌株进行筛选步骤，包括初筛子步骤及复筛子步骤，其中：(1)初筛子步骤包括：将直径3～6mm的圆滤纸片放置在淀粉琼脂平皿上，每平皿4～8个，分别吸取等量培养液点到滤纸片上，65℃干燥2h，用碘液检测并比较透明圈的直径，挑选透明圈直径大的30～50株进行复筛；(2)复筛子步骤包括：将30～50株初筛菌株，每种菌株3～5瓶，再次进行同(1)初筛方式的筛选，取3～5株作为第二代诱变的出发菌株，再次进行诱变及筛选步骤，第二代、第三代至第n代的筛选方法同第一代，至选育出高产淀粉菌株。2.根据权利要求1所述的诱变后高产淀粉酶菌株的筛选方法，其特征在于，所述的诱变后的菌株来自于下述步骤：(a)第一代出发菌株的筛选步骤：包括初筛步骤及复筛步骤，其中初筛步骤为碘染法，挑出滴加碘液产生透明圈的菌落进行复筛步骤，所述的复筛步骤为曲利苯蓝显色法，挑出产生透明圈的菌落；(b)第一代出发菌株的诱变步骤：通过所述的曲利苯蓝显色法挑选出的产生透明圈的菌落进行诱变处理。3.根据权利要求2所述的诱变后高产淀粉酶菌株的筛选方法，其特征在于，所述的(a)第一代出发菌的筛选步骤具体包括下述子步骤：(a-a)称取样品0.5g并编号，用无菌水充分稀释溶解，然后取等量转接至200mL富集液体培养基，于37℃培养箱中100～200r/min培养；(a-b)24h后，用无菌水对各样品进行10倍梯度稀释，吸取浓度为10-6的培养液100μL均匀涂布于筛选平板上，于37℃培养箱中培养45～50h；(a-c)加入碘液，观察标出有明显水解圈的菌落,从中选取染色圈直径与菌落直径比值大的单菌落编号并保存；(a-d)将挑选出的单菌落37℃培养箱中100～200r/...

【专利技术属性】
技术研发人员：金元昌，凌玲，吴银亮，蔡英桂，苏壬香，张建贺，
申请(专利权)人：湖南科技大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43