用于分离外来体的方法和组合物技术

本发明专利技术公开了用于分离细胞外微泡，例如外来体，特别是疾病‑相关的和磷脂酰丝氨酸(PS)‑阳性的细胞外微泡，例如肿瘤‑和病毒‑衍生的外来体)的惊人的新方法和组合物。本发明专利技术的方法是快速、高效、成本有效的，并且重要地，本发明专利技术的方法适用于大量的生物流体，并产生抗原性完整的细胞外微泡和外来体。所述的方法和组合物是基于在不破坏细胞外微泡的形态学特征或功能特征或者抗原性的条件下，醋酸盐缓冲剂从溶液中分离大量的细胞外微泡的惊人用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1.相关申请的交叉引用本申请要求2014年2月27日提交的共同待审的第一美国临时申请系列No.61/945,718和2014年3月26日提交的共同待审的第二美国临时申请系列No.61/970,529的优先权，这些申请的全部公开内容(包括说明书、权利要求书和附图)在不具有免责声明的情况下以引用方式并入本文。2.
本专利技术涉及生物
，特别是细胞外微泡，例如外来体。本专利技术提供了用于分离疾病相关的和磷脂酰丝氨酸(PS)-阳性的细胞外微泡，例如肿瘤-和病毒-衍生的外来体，特别是肿瘤-衍生的外来体的惊人的新方法和组合物，该新方法和组合物特别适用于与大量的生物流体一起使用，并产生抗原性完整的细胞外微泡和外来体。3.相关领域的描述细胞外微泡是由细胞释放或分泌的一类膜结合成分，包括外来体(exosome)、核外颗粒体(ectosome)、微颗粒或微泡、以及凋亡小体或小泡(et al.,2011；Simpson&Mathivanan,2012)。在这类细胞外微泡中，近年来外来体获得了特别的关注。外来体通常描述为40-50至100纳米大小的膜衍生的囊泡，并且已知其是由细胞在体内和体外主动分泌的。它们通过内体膜的向内出芽和分裂而由次级内体生成，从而产生包含腔内囊泡的多泡体(MVB)。这些外来体在MVB与细胞内质膜融合时与细胞外空间有关。由于它们来源于细胞的细胞质膜，并由内体膜的内陷而形成，所
以分泌的外来体具有细胞质膜和囊封细胞溶质衍生的水性空间的内体蛋白质。细胞外微泡(例如外来体)例如通过起分子信使(其传递不同细胞类型之间的信息)的作用而发挥广泛的重要的生理机能。例如外来体递送蛋白质、脂质和可溶性因子，包括RNA和microRNA(Thery et al.,2009)，它们根据来源而参与可以影响凋亡(Andreola et al.,2002；Huber et al.,2005；Kim et al.,2005)，转移(Parolini et al.,2009)，血管生成(Kim et al.,2005；Iero et al.,2008)，肿瘤进展(Keller et al.,2009；Thery et al.,2002)，血栓症(Aharon&Brenner,2009；Al Nedawi et al.,2005)，以及免疫力(通过使T细胞定向于免疫活化)(Andre et al.,2004；Chaput et al.,2005)或免疫抑制(Szajnik et al.,2010；Valenti et al.,2007；Wieckowski et al.,2009)的信号传导途径。已经描述用于从不同来源(包括得自癌症患者的癌性积水和外周血，以及得自体外培养的细胞系和肿瘤细胞的上清液)分离和纯化细胞外微泡和外来体群体的多种技术。这些方法包括差式离心，包括超速离心步骤(Thery et al.,2006)；亲和层析(Taylor&Gercel-Taylor,2008)；聚合物介导的沉淀(Taylor et al.,2011)，特别是使用不同分子量的聚乙二醇(PEG)，包括得自Life Technologies Corporation的Total Exosome Isolation Reagents(美国专利号8,901,284)和ExoQuickTM(US 2013/0337440A1)；以及在定义的孔径膜上的捕获(Grant et al.,2011)，例如ExoMirTM，其通常使用系列连接的不同孔径的2种过滤器(US 2013/0052647 A1)。但是，可利用的技术在2个重要的方面中受到缺点的限制。首先，通常在用于细胞外微泡和外来体制备时，所述的技术是耗时的、繁琐的和/或昂贵的，并且可以被加工的材料的量是有限的。具体而言，目前用于分离细胞外微泡和外来体的技术均需要体积显著减少，从而获得用于研究或使用的足够的浓度。在继续外来体分离之前，使用超速离心来浓缩生物介质的典型方法是极其耗时的，并且需要特定的试验室设备。其次，由于目前的技术应用于肿瘤衍生的细胞外微泡和外来体，所以它们是特别有限的。例如已经提出从癌症患者的循环体外除去外来体，其中患者的血液被泵送通过凝集素亲和柱，然后返回至患者(美国专利号8,288,172)。还报道可以使用顺磁珠纯化肿瘤衍生的外来体，其中所述的顺磁珠是使用针对肿瘤特异性蛋白质例如HER2/neu(Koga et al.,2005)的抗体涂敷。还可以使用利用磁珠以捕获特定外来体的试剂盒，例如Exo-FlowTM试剂盒。除了上文所述的一般缺点以外，此类方法和试剂盒是极其有限的，需要在抗体结合中利用的特定的外来体表面标志物以及所述的方案中许多详细的技术步骤的有利知识，例如生物素化的捕获抗体的制备和利用。因此，本领域仍需要分离细胞外微泡，例如外来体，特别是疾病相关的和肿瘤衍生的外来体的新的且改进的方法。对分离形态学和抗原性完整的细胞外微泡和外来体的、简单且成本有效的新方法的鉴定是重要的进展。真正需要的是以下方法：经过装配从而处理大量的生物材料，而无需专门的试验室设备，并且无需早期的超速离心步骤，并且真正需要的是可以用于优选地分离疾病相关的且肿瘤衍生的外来体的方法。专利技术概述本专利技术通过提供用于分离细胞外微泡，例如外来体，特别是疾病相关的和磷脂酰丝氨酸(PS)-阳性的外来体，包括肿瘤衍生的外来体的新方法和组合物来解决现有技术的上述的和其他的需要，其中所述的方法是快速、高效、成本有效的，且适用于大量的生物流体。这些方法是基于醋酸盐缓冲剂从溶液中分离细胞外微泡例如外来体的意外用途。本专利技术提供了分离大量细胞外微泡和外来体，特别是抗原性完整的、疾病相关的和PS-阳性的外来体，例如肿瘤衍生的外来体的能力，其中所述的外来体不能与通过目前的超速离心方法制备的那些外来体区分开，超速离心方法是耗时的、繁琐的并且是体积有限的。本专利技术的方法特别适用于分离或纯化通常与非脂质的膜成分(例
如膜蛋白质)结合的疾病-相关的、病毒-和肿瘤-衍生的外来体，其在表面上表达了负电荷的磷脂磷脂酰丝氨酸(PS)。醋酸盐缓冲剂意外地中和了细胞外微泡和外来体的表面电荷，由此除去了溶液中的这种表面电荷，而未破坏所得的细胞外微泡和外来体的形态学特征或功能特征，并且特别地，同时保持了它们的原始抗原图谱，这样它们是“抗原性完整的”。这种疾病-相关的外来体包括得自被病毒或细胞内寄生虫或病原体感染的细胞的那些，它们使得宿主细胞外化PS，并且是优选的肿瘤-衍生的外来体，它们在表面上通常包含大量的PS。本专利技术广泛适用的实施方案是从生物流体中分离疾病-相关的细胞外微泡的方法，其中疾病-相关的细胞外微泡在其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸；该方法包括将生物流体样品与以有效地使疾病-相关的细胞外微泡从生物流体中沉淀出来的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触，以及从沉淀物中收集疾病-相关的细胞外微泡，从而分离疾病-相关的细胞外微泡。此类方法包括从病毒感染的细胞分离细胞外微泡的那些，包括将包含病毒-衍生的细胞外微泡的生物流体与以有效地使病毒-衍生的细胞外微泡从生物流体中沉淀出来的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从生物流体分离疾病‑相关的细胞外微泡的方法，其中所述的疾病‑相关的细胞外微泡在其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸；所述的方法包括将所述的生物流体的样品与以有效地从所述的生物流体沉淀疾病‑相关的细胞外微泡的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触，以及从所述的沉淀物收集疾病‑相关的细胞外微泡，从而分离所述的疾病‑相关的细胞外微泡。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.27 US 61/945,718;2014.03.26 US 61/970,5291.一种从生物流体分离疾病-相关的细胞外微泡的方法，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡在其表面上具有带负电荷的磷脂酰丝氨酸；所述的方法包括将所述的生物流体的样品与以有效地从所述的生物流体沉淀疾病-相关的细胞外微泡的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触，以及从所述的沉淀物收集疾病-相关的细胞外微泡，从而分离所述的疾病-相关的细胞外微泡。2.权利要求1所述的方法，其中在所述的疾病-相关的细胞外微泡的表面上的磷脂酰丝氨酸与非-脂质的膜成分相连存在，并且其中所述的非-脂质的膜成分包含膜蛋白。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂中和所述的疾病-相关的细胞外微泡上的磷脂酰丝氨酸的表面电荷，由此从所述的生物流体沉淀所述的疾病-相关的细胞外微泡。4.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的生物流体包含细胞外微泡的混合群体，其中包括疾病-相关的和正常的细胞外微泡，并且其中所述的方法从所述的混合群体中选择性地沉淀所述的疾病-相关的细胞外微泡，这与所述的正常的细胞外微泡相反。5.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡在基本上不破坏其形态学特征或功能特征或者细胞表面抗原的条件下被分离。6.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的细胞外微泡为外来体。7.权利要求1至6的任意一项所述的方法，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡衍生自被细胞内寄生虫感染的细胞。8.权利要求1至6的任意一项所述的方法，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡衍生自病毒-感染的细胞。9.权利要求8所述的方法，其中所述的方法从病毒-感染的细胞分离疾病-相关的细胞外微泡，其中所述的病毒-感染的细胞疾基本上不具有感染性病毒。10.权利要求1至6的任意一项所述的方法，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡为肿瘤-衍生的细胞外微泡。11.权利要求10所述的方法，其中所述的肿瘤-衍生的细胞外微泡衍生自黑素瘤、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌或卵巢癌。12.权利要求10或11所述的方法，其中所述的肿瘤-衍生的细胞外微泡为肿瘤-衍生的外来体。13.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的疾病-相关的细胞外微泡为人类细胞外微泡。14.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂的pH为大约4.25至大约5.25。15.权利要求14所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂的pH为大约4.5至大约5.0。16.权利要求15所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂的pH为大约4.75。17.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂在所述的样品中的最终浓度为大约0.05M至大约0.25M。18.权利要求17所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂在所述的样品中的最终浓度为大约0.05M至大约0.1M。19.权利要求17所述的方法，其中将1/10体积的1.0M醋酸盐缓冲剂加入至所述的样品中。20.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂的pH为大约4.25至大约5.25，并且在所述的样品中的最终浓度为大约0.05M至大约0.25M。21.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂的pH为大约4.5至大约5.0，并且在所述的样品中的最终浓度为大约0.05M至大约0.1M。22.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂的pH为大约4.75，并且在所述的样品中的最终浓度为大约0.1M。23.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂包括醋酸钠。24.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂包括醋酸钾。25.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂实质上不具有除了聚合物以外的体积。26.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂实质上不具有聚乙二醇。27.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的醋酸盐缓冲剂为醋酸钠，pH为大约4.75，并且在所述的样品中的最终浓度为大约0.1M。28.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的生物流体为鼠、牛或人类生物流体。29.任何上述权利要求所述的方法，其中所述的生物流体为细胞培养物上清液、全血、血清、血浆、腹水、脑脊液、骨髓穿刺液、支气管肺泡洗液、尿、精液、阴道分泌物、黏液、唾液、痰或者从生物组织样品得到的澄清的裂解液。30.权利要求29所述的方法，其中所述的生物流体为细胞培养物上清液,血清,血浆或腹水。31.权利要求29所述的方法，其中所述的生物流体为澄清的细胞培养物上清液，其已经经过低速离心。32.权利要求29所述的方法，其中所述的生物流体为细胞培养物上清液，其得自在包含非-肿瘤细胞外微泡的血清存在下培养的肿瘤细胞。33.权利要求29所述的方法，其中所述的生物流体为细胞培养物
\t上清液，其得自在非-人类血清存在下培养的人类肿瘤细胞。34.权利要求29所述的方法，其中所述的生物流体为细胞培养物上清液，其得自在牛或胎牛血清存在下培养的小鼠或人类肿瘤细胞。35.任何上述权利要求所述的方法，其进一步包括以下步骤，将所述的生物流体经过低速离心从而除去细胞、细胞碎片和大的膜囊泡，然后与所述的醋酸盐缓冲剂接触。36.任何上述权利要求所述的方法，其中包含所述的疾病-相关的细胞外微泡的沉淀物在与所述的醋酸盐缓冲剂接触后，通过低速离心收集。37.任何上述权利要求所述的方法，其进一步包括将所收集的包含所述的疾病-相关的细胞外微泡的沉淀物再次悬浮于大约中性pH的基本上不具有醋酸盐的缓冲剂中，从而提供疾病-相关的细胞外微泡的分离群体。38.权利要求37所述的方法，其进一步包括对所述的疾病-相关的细胞外微泡的分离群体进行离心，从而除去污染性成分，由此提供疾病-相关的细胞外微泡的基本纯的组合物。39.权利要求12所述的方法，其中所述的方法包括：(a)获得生物流体，该生物流体包含包括肿瘤-衍生的外来体和非-肿瘤外来体的外来体的混合群体；(b)将所述的生物流体与以有效地从所述的生物流体选择性地沉淀肿瘤-衍生的外来体、而并非非-肿瘤外来体的pH和浓度的醋酸盐缓冲剂接触。(c)从步骤(b)收集所述的沉淀物，其中所述的沉淀物选择性
\t地包含所述的肿瘤-衍生的外来体；以及(d)在大约中性的pH下，使所述的沉淀物再次悬浮于基本上不含醋酸盐的缓冲剂中，从而提供实质上不具有非肿瘤外来体的肿瘤-衍生的外来体的纯化群体。40.权利要求39所述的方法，其中所述的方法包括：(a)获得生物流体，该生物流体包含包括肿瘤-衍生的外来体和非-肿瘤外来体的外来体的混合群体；(b)对所述的生物流体实施第一低速离心，从而提供实质上不具有细胞、细胞碎片和大的膜囊泡的澄清的流体；(c)在有效地提供浑浊悬液的pH和浓度下、以及在有效地提供浑浊悬液的时间内，将所述的澄清的流体与醋酸盐缓冲剂温育，其中所述的悬液包含选择性沉淀的肿瘤-衍生的外来体，但是基本上不包含沉淀的非-肿瘤的外来体；(d)对所述的浑浊悬液进行低速离心，从而提供沉淀物和上清液，其中所述的沉淀物选择性...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·J·施洛特，P·E·特洛佩，S·P·M·富希，
申请(专利权)人：得克萨斯大学体系董事会，派瑞格恩医药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US