半胱氨酸工程化III型纤连蛋白域结合分子制造技术

本发明专利技术公开了含经半胱氨酸改造的单特异性和双特异性EGFR和/或c‑Met FN3结构域的分子，所述分子包含一个或多个游离半胱氨酸氨基酸，所述分子通过以下来制备：诱变亲本分子的核酸序列并且用半胱氨酸替换一个或多个氨基酸残基以编码含有所述经半胱氨酸改造的FN3结构域的单特异性或双特异性分子；表达含有所述经半胱氨酸改造的FN3结构域的分子；以及回收含有所述经半胱氨酸改造的FN3结构域的分子。所述含有分离的经半胱氨酸改造的单特异性或双特异性FN3结构域的分子可共价附接到检测标记或药物部分并且以治疗方式使用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用半胱氨酸残基改造的结合分子，以及其制备和使用它们的方法。更具体地，本专利技术涉及III型纤连蛋白(FN3)结构域分子，该分子可结合到经半胱氨酸改造的EGFR和/或c-Met。
技术介绍
表皮生长因子受体(EGFR或ErbB1或HER1)是一种170kDa的跨膜糖蛋白，该糖蛋白由c-erbB1原癌基因编码。EGFR是受体酪氨酸激酶(RTK)的人表皮生长因子受体(HER)家族的成员，该家族包括HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)。这些RTK共享同源结构，所述同源结构由配体结合胞外结构域(ECD)、单一跨膜结构域和胞内结构域组成，该胞内结构域包含催化激酶结构域和C-端尾。EGFR信号传导由配体结合引发，然后诱导受体的构象变化、二聚化和反式自磷酸化(Ferguson等人，Annu Rev Biophys，37：353-73，2008)，这将引发信号转导级联，所述信号转导级联最终影响多种细胞功能，包括细胞增殖和存活。人们已将EGFR的表达或激酶活性的增加与多种人类癌症相关联，使得EGFR成为治疗干预的有吸引力的靶标(Mendelsohn等人，Oncogene 19：6550-6565，2000；Grünwald等人，J Natl CancerInst 95：851-67，2003；Mendelsohn等人，Semin Oncol 33：369-85，2006)。此外，EGFR基因拷贝数和蛋白质表达这两者的增加也被与对非小细胞肺癌中的EGFR酪氨酸激酶抑制剂IRESSATM(吉非替尼)的有利响应相关联(Hirsch等人，Ann Oncol 18：752-60，2007)。EGFR治疗包括小分子和抗EGFR抗体两者，其被批准用于治疗结直肠癌、胰腺癌、头颈癌和非小细胞肺癌(NSCLC)(Baselga和Arteaga，J Clin Oncol 23：2445-2459(2005)；Gill等人，J Biol Chem，259：7755-7760，1984；Goldstein等人，Clin Cancer Res，1：1311-1318；1995；Prewett等人，Clin Cancer Res，4：2957-2966，1998)。抗EGFR治疗的功效可取决于肿瘤类型和肿瘤中的EFGR突变/扩增状态，并且可导致皮肤毒性(De Roock等人，Lancet Oncol 11：753-762，2010；Linardou等人，Nat RevClin Oncol，6：352-366，2009；Li和Perez-Soler，Targ Oncol 4：107-119，2009)。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)通常用作对于非小细胞肺癌(NSCLC)的二线治疗，但是由于抗性途径通常在十二个月内停止工作(Riely等人，Clin Cancer Res 12：839-44，2006)。c-Met编码酪氨酸激酶受体。它是在发现用致癌物治疗可产生组成型活性融合蛋白TPR-MET之后于1984年最先被鉴定出的原癌基因(Cooper等人，Nature 311：29-33，1984)。c-Met通过其配体HGF实现的激活刺激了过多的细胞过程，包括生长、运动、侵入、转移、上皮-间质转化、血管生成/伤口愈合和组织再生(Christensen等人，Cancer Lett 225：1-26，2005；Peters和Adjei，Nat Rev Clin Oncol 9：314-26，2012)。c-Met被合成为单链蛋白，该单链蛋白通过蛋白水解裂解为由二硫键连接的50kDaα-亚基和140kDaβ-亚基(Ma等人，Cancer and Metastasis Reviews，22：309-325，2003)。c-Met在结构上类似于其他膜受体(诸如Ron和Sea)，并且由胞外配体结合结构域、跨膜结构域和胞质结构域(包含酪氨酸激酶结构域和C-端尾区结构域)构成。HGF：c-Met结合的准确化学计量目前尚不清楚，但是通常认为，两个HGF分子结合到两个c-Met分子导致在酪氨酸1230、1234和1235处的受体二聚化和自磷酸化(Stamos等人，The EMBO Journal 23：2325-2335，2004)。非配体依赖性c-Met自磷酸化也可由于基因扩增、突变或受体过表达而发生。c-Met在许多类型的癌症中频繁扩增、突变或过表达，所述癌症包括胃癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、胰腺癌和中枢神经系统癌。通常定位于激酶结构域的错义突变常见于遗传性乳头状肾癌(PRCC)中以及13％的散发性PRCC中(Schmidt等人，Oncogene 18：2343-2350，1999)。相比之下，定位于脑信号蛋白或c-Met的近膜结构域的c-Met突变则常常见于胃癌、头颈癌、肝癌、卵巢癌、NSCLC和甲状腺癌中(Ma等人，Cancer and Metastasis Reviews，22：309-325，2003；Sakakura等人，Chromosomes and Cancer，1999.24：299-305)。已在脑癌、结直肠癌、胃癌和肺癌中检测到c-Met扩增，通常与疾病进展相关(Ma等人，Cancer and Metastasis Reviews，22：309-325，2003)。非小细胞肺癌(NSCLC)和胃癌中最多分别有4％和20％表现出c-Met扩增(Sakakura等人，Chromosomes and Cancer，1999.24：299-305；Sierra和Tsao，Therapeutic Advancesin Medical Oncology，3：S21-35，2011)。即使在不存在基因扩增的情况下，也常在肺癌中观察到c-Met过表达(Ichimura等人，Jpn J Cancer Res，87：1063-9，1996)。此外，在临床样本中，近一半的肺腺癌表现出高水平的c-Met和HGF，这两者均与提高的肿瘤生长速率、转移和不良预后相关(Sierra和Tsao，Therapeutic Advances in Medical Oncology，3：S21-35，2011；Siegfried等人，Ann Thorac Surg 66：1915-8，1998)。所有肿瘤中接近60％变得对EGFR酪氨酸激酶抑制剂具有抗性，这增加了c-Met的表达、扩增了c-Met或增加了其唯一已知的配体HGF(Turke等人，Cancer Cell，17：77-88，2010)，从而表明对于EGFR存在通过c-Met的补偿途径。c-Met扩增最初是在培养的细胞中发现的，所述细胞变得对吉非替尼(一种EGFR激酶抑制剂)具有抗性，并且通过Her3途径表现出提高的存活率(Engelman等人，Science，316：1039-43，2007)。这在临床样本中得到进一步验证，其中具有所获得的对埃罗替尼或吉非替尼的抗性的43位患者中有九位表现出c-Met扩增，而62位未经治疗的患者中仅两位表现出c-Met扩增。有趣的是，九位经过治疗的患者中有四位还获得了EGFR激活突变T790M本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其包含在选自FN3结构域的残基6、8、10、11、14、15、16、20、30、34、38、40、41、45、47、48、53、54、59、60、62、64、70、88、89、90、91和93的位置处的至少一个半胱氨酸取代，其中所述FN3结构域基于SEQ ID NO:1。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.14 US 61/8905391.一种分离的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其包含在选自FN3结构域的残基6、8、10、11、14、15、16、20、30、34、38、40、41、45、47、48、53、54、59、60、62、64、70、88、89、90、91和93的位置处的至少一个半胱氨酸取代，其中所述FN3结构域基于SEQ ID NO:1。2.根据权利要求1所述的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其中所述半胱氨酸取代位于选自SEQ ID NO:111-114或122-137的残基6、8、10、11、14、15、16、20、30、34、38、40、41、45、47、48、53、54、59、60、62、64、70、88、89、90、91和93的位置处。3.一种分离的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，其中至少一个半胱氨酸取代来自SEQ ID NO:27的氨基酸序列，其中所述分离的经半胱氨酸改造的FN3结构域特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)并阻碍表皮生长因子(EGF)与EGFR的结合。4.一种分离的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列，其中至少一个半胱氨酸取代来自SEQ ID NO:114的氨基酸序列，其中所述分离的经半胱氨酸改造的FN3特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-Met)并阻碍肝细胞生长因子(HGF)与c-Met的结合。5.根据权利要求1所述的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其还包含半衰期延长部分。6.根据权利要求6所述的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其中所述半衰期延长部分为结合白蛋白的分子、聚乙二醇(PEG)，或免疫球蛋白的Fc区的至少一部分。7.一种制备经半胱氨酸改造的FN3结构域的方法，其包括：(i) 通过用编码半胱氨酸氨基酸残基的核苷酸残基替换一个或多个核苷酸残基来诱变亲本FN3结构域的核酸序列，以编码所述经半胱氨酸改造的FN3结构域；(ii) 表达所述经半胱氨酸改造的FN3结构域；以及(iii) 回收所述经半胱氨酸改造的FN3结构域。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述FN3结构域基于SEQ ID NO:1，并且所述诱变步骤包括进行定点诱变。9.根据权利要求8所述的方法，其包括在大肠杆菌(E.coli)中表达所述经半胱氨酸改造的FN3结构域。10.根据权利要求8所述的方法，其还包括在所述回收步骤之后：将所述经半胱氨酸改造的FN3结构域与硫醇反应性化学试剂反应，以生成化学缀合的经半胱氨酸改造的FN3结构域。11.根据权利要求10所述的方法，其还包括在所述反应步骤之后，测量所述化学缀合的经半胱氨酸改造的FN3结构域的EGFR结合。12.根据权利要求11所述的方法，其还包括在所述反应步骤之后，在添加所述化学缀合的经半胱氨酸改造的FN3结构域之后测量EGFR过表达肿瘤细胞系的细胞生长的抑制。13.根据权利要求11所述的方法，其还包括在所述反应步骤之后，测量所述化学缀合的经半胱氨酸改造的FN3结构域的c-Met结合。14.根据权利要求11所述的方法，其还包括在所述反应步骤之后，在添加所述化学缀合的经半胱氨酸改造的FN3结构域之后测量c-Met表达肿瘤细胞系的细胞生长的抑制。15.根据权利要求11所述的方法，其中所述硫醇反应性试剂包含马来酰亚胺部分。16.根据权利要求15所述的方法，其中包含所述马来酰亚胺部分的所述硫醇反应性试剂选自NEM、MMAE和MMAF。17.根据权利要求16所述的方法，其中在EGFR过表达H1573细胞中测量时，所述化学缀合的经半胱氨酸改造的FN3结构域具有介于约1.7×10-10M和约1.3×10-9M之间的细胞生长IC50值。18.一种分离的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其包含选自SEQ IDNO:189-216和227-254的氨基酸序列。19.一种分离的经半胱氨酸改造的双特异性FN3分子，其包含第一III型纤连蛋白(FN3)...

【专利技术属性】
技术研发人员：S戈德伯格，S贾科布斯，T林，K奥内尔，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国;US