本申请公开了利用土霉素正调控基因构建重组菌和提高土霉素产量的方法。土霉素正调控基因otcR，选自编码序列表的氨基酸序列3所示的正调控蛋白OtcR的基因；和编码具有所述OtcR蛋白活性的多肽的基因中的一个，优选序列表的核苷酸序列1所示基因。利用该基因构建一系列多个拷贝的otcR过表达质粒，并将这些重组质粒分别整合到龟裂链霉菌基因组上，增强土霉素合成的代谢途径，获得高产土霉素的工程菌株。本发明专利技术的工程菌株制备简单易得，土霉素产量高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物制药领域，具体涉及土霉素正调控基因重组质粒及高产土霉素工程菌株的构建，为医药及工业生产提供了一种提高土霉素产量的方法。
技术介绍
链霉菌(Streptomyces)常见于土壤及腐烂植物中，为好氧、具有丝状分枝细胞的革兰氏阳性菌，属于原核生物界放线菌纲链霉菌科。链霉菌的一个重要生理特点是能合成丰富的、类型多样的有着重要医药及工农业应用价值的次级代谢产物，如：抗生素、抗肿瘤化合物、免疫调节剂和杀虫剂等。在已知的由微生物产生的抗生素中，约三分之二源自放线菌，而其中的80％以上又来源于链霉菌，因而链霉菌被人们称为药物的天然合成工厂。龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)是土霉素(Oxytetracycline，OTC)的生产菌，目前关于龟裂链霉菌的遗传学研究主要集中在俄罗斯国家工业微生物保藏中心和全俄抗生素研究中心、英国Pfizer制药研究中心和克罗地亚PLIVA研究所等。已公开的研究的菌株名称分别是Russian(LS-TI18),Pfizer(M4018)和Zagreb(R6)。同时在世界上最大的生物资源中心——美国模式培养物集存库(Americantypeculturecollection，ATCC)中，保存有编号10970的龟裂链霉菌菌株，该菌株常作为研究土霉素合成代谢途径的模式菌株。2013年，Streptomycesrimosussubsp.rimosusATCC10970全基因组测序完成并公开(GenBank：ANSJ00000000，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ANSJ00000000.Pethick,F.E.,etal..DraftGenomeSequenceoftheOxytetracycline-ProducingBacteriumStreptomycesrimosusATCC10970.GenomeAnnounc,2013,1(2):e0006313.)；2014年，曾经用于工业生产土霉素的菌株StreptomycesrimosusR6-500全基因组测序完成并公布(Genbank：JMGY00000000，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JMGY00000000.Baranasic,D.,etal.(2014).\GenomeSequencesoftheOxytetracyclineProductionStrainStreptomycesrimosusR6-500andTwoMutantswithChromosomalRearrangements.\GenomeAnnounc2(4).)。在前期的研究和已公布的龟裂链霉菌全基因组序列基础上，近年来TangYi等研究团队深入全面的揭示了土霉素的合成代谢途径(Pickens,L.B.andY.Tang.Oxytetracyclinebiosynthesis.JBiolChem,2010,285(36):27509-27515.)，对土霉素合成途径的20个结构基因进行了实验研究和功能预测，然而土霉素合成途径中调控基因的研究仍是一块空白。土霉素是四环素类广谱抗生素，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体、衣原体、立克次氏体等引起的感染有很好疗效，在畜牧业以及水产养殖方面也具有广泛的应用，因此具有重要的市场价值。土霉素的主要作用机制是能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，阻止氨酰tRNA核糖体复合体的形成，进而抑制蛋白质肽链的增长(PetkovicH,CullumJ,HranueliD,etal.GeneticsofStreptomycesrimosus,theOxytetracyclineProducer.MicrobialMolBiolR,2006,70(3):704-728)。自然界分离得到的野生菌株生产抗生素的水平一般很低，不符合工业化生产的要求，因此如何将野生低产菌株改造成为适合大规模发酵的高产菌株，成为微生物制药能否真正产业化的关键。目前改造的方法有传统物理化学诱变，基因组改组，核糖体工程等；此外还有一些代谢工程的方法，比如启动子替换，增加结构基因或合成途径中限速酶的拷贝数，失活阻遏蛋白，过表达正调控基因或途径特异性激活子等方法。放线菌中的绝大部分途径特异性的激活子都属于链霉菌抗生素调控蛋白(StreptomycesAntibioticRegulatoryProteins，SARP)家族。过表达SARP家族的正调控因子可导致多种抗生素产量的提高，如过表达redD和actII-orf4导致天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)中放线紫红素和十一烷基灵菌红素产量提高(Fernandez-Moreno,M.A.,J.L.Caballero,D.A.Hopwood,andF.Malpartida.Theactclustercontainsregulatoryandantibioticexportgenes,directtargetsfortranslationalcontrolbythebldAtRNAgeneofStreptomyces.Cell,1991,66:769-780.Narva,K.E.,andJ.S.Feitelson.NucleotidesequenceandtranscriptionalanalysisoftheredDlocusofStreptomycescoelicolorA3(2).JBacteriol,1990,172:326-333.)。近年来，分子生物学技术迅猛的发展，如Gibson研究团队开发的体外等温一步法DNA组装技术(Gibson,D.G.,etal.EnzymaticassemblyofDNAmoleculesuptoseveralhundredkilobases.NatMethods,2009,6(5):343-345.)，使得利用基因工程技术改造微生物代谢途径变得更加容易。
技术实现思路
针对上述情况，为了提高龟裂链霉菌土霉素产量，适应工业生产的需求，本专利技术人对土霉素合成的调控基因进行了研究，发现了一种新的土霉素合成的正调控基因otcR，并利用该基因通过体外DNA重组技术构建了过表达土霉素合成的正调控基因(otcR)质粒并由此获得了适用于大规模工业生产的高产工程菌株，同时提供一种能够提高龟裂链霉菌土霉素产量的方法。为了达到上述目的，本专利技术一方面提供一种土霉素合成的正调控基因...
【技术保护点】
一种土霉素合成的正调控基因otcR，所述基因为选自编码序列表的氨基酸序列3所示的正调控蛋白OtcR的基因；和编码具有所述OtcR蛋白活性的多肽的基因中的一个；优选地，所述基因为序列表的核苷酸序列1所示基因。
【技术特征摘要】
1.一种土霉素合成的正调控基因otcR，所述基因为选自编码序列表的
氨基酸序列3所示的正调控蛋白OtcR的基因；和编码具有所述OtcR蛋白
活性的多肽的基因中的一个；优选地，所述基因为序列表的核苷酸序列1
所示基因。
2.一种土霉素合成的正调控蛋白OtcR，所述蛋白为序列表的氨基酸序
列3所示的蛋白。
3.一种重组龟裂链霉菌，所述重组龟裂链霉菌是在产土霉素的龟裂链
霉菌中过表达序列表的序列3所示的OtcR蛋白的菌株。
4.根据权利要求3所述的重组龟裂链霉菌，其中所述重组龟裂链霉菌
的基因组中包含至少2个，优选2～6个，更优选3～4个拷贝的土霉素合
成的正调控基因otcR，所述基因为选自编码序列表的氨基酸序列3所示的
正调控蛋白OtcR的基因，和编码具有所述OtcR蛋白活性的多肽的基因中
的一个；优选地，所述基因为序列表的核苷酸序列1所示基因。
5.根据权利要求3所述的重组龟裂链霉菌，其中所述过表达序列表的
序列3所示的OtcR蛋白的方法包括：构建含至少1个，优选1～5个，更
优选为2～3个拷贝的otcR基因的重组质粒，并将所述重组质粒整合到龟裂
链霉菌的基因组上，其中所述otcR基因是选自编码所述OtcR蛋白或具有
所述OtcR蛋白活性的多肽的核苷酸序列和...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨克迁，王为善，尹守亮，王娟，王雪峰，贾晓乐，袁昉，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，河北圣雪大成制药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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