一种应用角质酶合成短链芳香酯的方法技术

本发明专利技术涉及一种应用角质酶合成短链芳香酯的方法，属于酶工程和发酵工程技术领域。本发明专利技术以毕赤酵母为宿主菌构建一种过量表达角质酶的基因工程菌，诱导该菌发酵产角质酶，发酵液上清中角质酶酶活达到420U/mL。本发明专利技术进一步利用该重组酶在有机相、黄酒催陈和白酒固态发酵中生产短链芳香酯。本方法有酶源制备方法简单、成本低，酶量大，短链芳香酯生产方法简单、转化率高、产量高、时间短等优点，利于工业化放大生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种应用角质酶合成短链芳香酯的方法，属于酶工程和发酵工程

技术介绍
短链芳香酯是由短链脂肪酸(C2-C10)和醇(C2-C6)合成的酯，在自然界香料组成中占有很大比例，普遍被用于在食品、化妆品、饮料等行业。如乙酸乙酯被广泛用于水果香精和各种香料的生产，其2014年世界总消费水平达到2800kt/a。而丁酸乙酯具有类似凤梨香气，普遍被用于配制各种食用、酒用和烟草香精等。而作为浓香型白酒主要呈香物质的己酸乙酯，其全国产量已超过3000t。又如具有酒香味的乳酸乙酯，其特殊香味能够改善酒的品质。这些短链芳香酯类物质不仅在世界食品添加剂中占有重要地位，同时也是国内外许多食品、饮料、化妆品企业首选的添加剂，其市场需求量必然会随着经济的快速发展呈现稳步的增长趋势。通常短链芳香酯可以通过从植物中提取或者利用化学催化剂合成。前者得到的是混合酯类物质、浓度低、提取量少，从而使其生产成本比较高，且其含量远不能满足人们的需求；而化学合成方法则是用强酸或者强碱作为催化剂在高温高压下反应生成，不仅会有副产物形成，影响产品纯度和质量，而且需要后处理工序，由此产生的废液会对环境造成污染，强酸强碱等催化剂的腐蚀性也会加速对生产设备的损坏。与化学合成相比，酶催化合成反应具有区域选择性和位置专一性、条件温和、不会造成环境污染，且产品更易被大众接受。这对于提升人们的生活质量和环境保护具有重要意义。因此，利用生物转化法制备芳香酯将成为必然趋势。随着分子生物学技术的不断进步，生物酶法催化合成芳香酯类物质的报道愈来愈多。近年来，越来越多的研究者在酒的加曲配料、发酵、蒸粮蒸酒/煎酒/压榨、勾兑、丢糟再利用和陈化等环节中加入不同的酶制剂，以期改善白酒中的风味物质，尤其是酯类物质的含量，来提高酒的品质，得到更多的优质酒。而大部分脂肪酶一般对长链底物的特异选择性比较好，且相对较低的稳定性阻碍了其在工业大规模生产中的应用。此外，白酒酒醅/黄酒发酵过程中，乙醇和酸的浓度会不断上升，外源添加的酶难以在复杂的白酒发酵环境中发挥预期的作用。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一种角质酶合成短链芳香酯的方法，是以核苷酸序列如NCBIGeneID：KF193402所示的基因编码的角质酶为催化剂，以C2-C10短链脂肪酸和C2-C6醇为底物合成短链芳香酯。在本专利技术的一种实施方式中，所述角质酶是以发酵所得粗酶液或者冻干酶粉的形式添加到反应体系中。在本专利技术的一种实施方式中，反应体系中，以无水异辛烷或正庚烷为溶剂，酸和醇的摩尔比为1:1.5，加入10-120U/mL的角质酶，控制反应体系中的初始含水量的质量百分比为0.01-0.1％，于30-70℃反应20-24h。在本专利技术的一种实施方式中，所述短链芳香酯包括乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸丁酯、丁酸己酯、丁酸辛酯、丁酸癸酯。在本专利技术的一种实施方式中，以无水异辛烷或正己烷为溶剂，己酸浓度0.1mol/L，己酸/乙醇摩尔比1:1.5，冻干角质酶粉的用量为40U/mL，控制反应体系中的初始含水量的质量百分比为0.04％，于50℃反应16h，得到己酸乙酯。在本专利技术的一种实施方式中，为了得到所述角质酶，构建了一株高产所述角质酶的基因工程菌，是将NCBIGeneID：KF193402所示的基因序列，转化到毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71中得到的重组菌。在本专利技术的一种实施方式中，为了得到所述角质酶，以构建的高产所述角质酶的基因工程菌发酵生产角质酶；所述发酵过程维持溶氧在20-30％，温度控制在30℃左右，控制pH5.0左右，包括分批发酵阶段、补料培养阶段、诱导阶段；所述分批发酵阶段，是将种子培养液接入发酵培养基中，培养18-19h；所述补料培养阶段是当发酵培养基中初始添加的甘油耗尽溶氧回升，以指数流加的方式补加甘油，直到达到OD600为50～150时，停止流加甘油；所述诱导阶段，是待培养基中的甘油被消耗完，流加甲醇诱导角质酶表达，将甲醇浓度维持在体积分数0.5％-2％，诱导120-140h。在本专利技术的一种实施方式中，发酵培养基(BSM)组成：CaSO4.2H2O0.939g/L，MgSO4·7H2O14.9g/L，KOH4.13g/L，K2SO418.2g/L，甘油30.0g/L，85％H3PO426.7mL/L，微量元素液PTM14.3mL/L；微量元素液PTM1的组成：FeSO4·7H2O65g/L，KI0.08g/L，H2SO45.0g/L，MnSO4·H2O3g/L，CuSO4·5H2O6g/L，H3BO30.02g/L，Na2MoO3·2H2O0.2g/L，CoCl20.5g/L，ZnCl220g/L。补料阶段流加的甘油是含有5mL/L微量元素液PTM1的甘油。诱导阶段流加的甲醇是含有12mL/L微量元素液PTM1的甲醇。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种应用角质酶黄酒原酒催陈的方法，是向沙洲优黄原酒中添加40U/mL的以核苷酸序列如NCBIGeneID：KF193402所示的基因编码的角质酶，于37℃反应24h，加速黄酒原酒中短链芳香酯含量的变化。本专利技术要解决的第三个技术问题是提供一种应用所述角质酶固态发酵清香型白酒的方法，是向发酵糟醅中添加角质酶，然后与发酵糟醅一同入池发酵，利用所述角质酶合成短链芳香酯。本专利技术通过选择高耐酸性的角质酶进行重组表达和发酵生产，获得单位酶活420U/mL的发酵酶液，弥补了野生菌酶活单位低的缺点，为低成本大量制酶奠定基础。同时，本专利技术获得的角质酶在酸性pH反应条件下具有良好的活性和稳定性，在pH3.5～pH6.5条件下保温168h后残余酶活大于50％；在30℃下半衰期高达101d，在50％的各种有机溶剂中(甲醇、异辛烷、乙醇、丁醇、异丙醇、丙酮、乙腈、二甲亚砜)稳定性较好，残留酶活在60％以上。用该酶进行酯化反应生产短链芳香酯，具有反应方法简便、不需要提供额外生物能量等优点。在黄酒黄酒原酒催陈中，能够显著提高芳香酯的含量。在白酒固态发酵中，显著提高酒中的总酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量使白酒显著增香。附图说明图1重组酶的SDS-PAGE分析：M：Marker；1：重组角质酶纯酶；2:硫酸铵沉淀；3：发酵上清液图2重组酶的最适pH图3重组酶的pH稳定性图4重组酶的最适温度图5重组酶的温度稳定性图6重组酶在有机溶剂中的稳定性图7温度对己酸乙酯转化率的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种合成短链芳香酯的方法，其特征在于，是以核苷酸序列如NCBI Gene ID：KF193402所示的基因编码的角质酶为催化剂，以C2‑C10短链脂肪酸和C2‑C6醇为底物合成短链芳香酯。

【技术特征摘要】
1.一种合成短链芳香酯的方法，其特征在于，是以核苷酸序列如NCBIGeneID：KF193402
所示的基因编码的角质酶为催化剂，以C2-C10短链脂肪酸和C2-C6醇为底物合成短链芳香酯。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述角质酶是以发酵所得粗酶液或者冻干
酶粉的形式添加到反应体系中。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以无水异辛烷或正庚烷为溶剂，酸和醇的
摩尔比为1:1.5，加入10-120U/mL的角质酶，控制反应体系中的初始含水量的质量百分比为
0.01-0.1％，于30-70℃反应20-24h。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述短链芳香酯包括乙酸乙酯、丁
酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸丁酯、丁酸己酯、丁酸辛酯、丁酸癸酯。
5.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，以无水异辛烷或正己烷为溶剂，己
酸浓度0.1mol/L，己酸/乙醇摩尔比1:1.5，冻干角质酶粉的用量为40U/mL，控制反应体系中
的初始含水量的质量百分比为0.04％，于50℃反应16h，得到己酸乙酯。
6.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，为了得到所述角质酶，构建了一株
高产所述角质酶的基因工程菌，是将NCBIGeneID：KF193402所示的基因序列，转化到毕
赤酵母(Pichiapastoris)KM71中得到的重组菌，用于诱导培养产角质酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以构建的重组菌发酵生产角质酶；所述发
酵过程维持溶氧在20-30％，温度控制在30℃左右，控制pH5.0左右，包括分批发酵阶段、
补料培养阶段、诱导阶段；所述分批发酵阶段，是将种子培养液接入发酵培养基中，培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，宿玲恰，郭小杰，
申请(专利权)人：江南大学，江南大学如皋食品生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32