双特异性纳米抗体制造技术

本发明专利技术涉及包含第一和第二免疫球蛋白单可变结构域(ISV)的双特异性多肽，其中所述第一ISV以低亲和力结合癌细胞表面上的第一靶标并且，当结合时抑制所述第一靶标的功能，并且所述第二ISV以高亲和力结合所述细胞表面上的第二靶标，并且其中所述第一靶标不同于所述第二靶标。本发明专利技术还公开了鉴定和制备它们的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及包含第一、功能性的单可变结构域和第二、锚定免疫球蛋白的单可变结构域(ISV)的双特异性多肽，其中所述第一ISV以低亲和力结合癌细胞表面上的第一靶标并且，当结合时抑制所述第一靶标的功能，并且所述第二ISV以高亲和力结合所述细胞表面上的第二靶标，并且其中所述第一靶标不同于所述第二靶标。本专利技术还公开了用于鉴定和制备它们的方法。背景在历史上，癌症治疗的模态的主要问题是缺乏对癌细胞的特异性。癌症治疗的新时代以抗体开始，抗体可以赋予真正的特异和靶向治疗。已经在1997年批准了第一个单克隆抗体，即利妥昔单抗(rituximab)。单克隆抗体现在被广泛认为是治疗性分子，仅在美国就批准了23个，其中已经有9个在癌症领域。不幸的是，它们中没有一个能够作为单个药剂治愈癌症。尽管如此，当今最畅销的十种药物中的六种是单克隆抗体。该初步成功促使很多公司也开发基于单克隆抗体的疗法。然而，与进入临床研究的单克隆抗体的数量相比，批准的单克隆抗体治疗的比率下降。各种癌细胞过表达参与恶性过程的靶标。HER2和FGFR是公知的实例。尽管如此，不是所有恶性细胞都过表达促进恶性疾病的靶标。此外，癌细胞在其表面上很少具有唯一的靶标。取而代之的是，与正常细胞相比，癌细胞具有基本上不同的靶标构成。实质上，正常和恶性细胞之间的很多差异仅是表达差异。这也是为什么诊断性生物标志物如此难以确认癌症的一个原因。考虑到治疗性抗体将不仅结合其在癌细胞上的同源靶标，而且也结合正常细胞上的，影响二者的功能，目前的癌症治疗遇到杀伤癌细胞而规避正常细胞的困难并不奇怪。这导致毒性和不需要的副作用。最常观察到的这些治疗的副作用包括恶心、腹泻、便秘、血凝结和伤口愈合的问题、高血压、胃肠穿孔、头晕、贫血、肺气肿、疼痛和疲乏。对于患者，这样的副作用可以影响日常生活。在最好的情况下，它们可能使患者不舒适，并且在最坏的情况下，使患者痛苦，影响他们坚持其治疗的能力，或使得治疗比它们本可以获得的效果差。这些副作用对患者以及社会二者都产生高的负担。因为副作用和毒性，很多临床试验甚至不得不停止。例如，GSK的抗体12F4的最初结果看起来非常有希望。然而，心血管事件使得需要停止临床研究。另一实例由CDP860对PDGFRβ的阻断提供，CDP860是改造的Fab’片段-聚乙二醇缀合物，其导致患有卵巢癌或结肠癌的患者中严重的积液，与增加的肿瘤血管体积相关(Jayson等人2005，JClinOncol23:973-981)。通过增加抗体对于功能性靶标的亲和力，尝试减小毒性和副作用。因此，可以施用较低剂量的抗体，其会优先结合过表达这些靶标的癌细胞，但较少结合具有较少靶标的正常细胞。尽管在理论上，这会减小毒性和副作用，但是增加亲和力的主要缺点是由于靶标介导的内化后抗体的快速去除导致的降低的肿瘤穿透(Schmidt等人2008CancImmImm57(12)：1879–1890；Ackermann等人2008MolCancerTher2008；7:2233-2240)。通过形成结合两个不同靶标的双特异性抗体进一步尝试减小毒性和不需要的副作用(参见综述：Kontermann，MAbs20124(2):182-97.doi：10.4161/mabs.4.2.19000.Epub2012年3月1日：利用双特异性抗体的双重靶向策略(Dualtargetingstrategieswithbispecificantibodies))。双特异性抗体基本上可以用于以两种方式双重靶向表面受体：(i)通过靶向在相同细胞上表达的细胞表面受体(通过顺式作用)，和(ii)用于重新靶向治疗活性部分，即，效应分子和效应细胞(通过反式作用)。在其最简单的顺式形式，与正常细胞相比，癌细胞可以被认为包含两个靶标的唯一组合。该靶标组合不如此存在于正常细胞上，而是各个单独的靶标存在于特定正常细胞类型上。仅提供各自结合特异靶标的两种单克隆抗体(mAbs)的混合物不会增加对癌细胞的特异性。因此猜测该缺点能够通过产生能够同时结合两个不同靶标的双特异性抗体来克服(参见例如Chames和Baty2009mAbsI:6539-549)。尽管已经成功产生了双特异性抗体，但是因为它们需要融合重链和轻链，其在实践中导致错误融合产物的过度表达，因此它们难以生产。因此已经建议了各种不同双特异性形式，大多数基于将单价片段合并，但其没有一个被批准。据信，单价片段缺乏常规抗体的所需高亲和力和长保留时间。MEHD7945A是对EGFR和Her3具有特异性的二合一Mab的实例，其目前在早期临床试验中被测试。两个臂都具有对EGFR(1.9nM)、和Her3(0.39nM)的高亲和力，但未显示同时结合两种受体。总之，很少有基于这样形式的候选物进入临床。基于此，提示开发新的形式。除了形式之外，认为理想的是，双特异性抗体中的每个个体结合结构域应该结合促使恶化的靶标，从而挫败可能的单个靶标的冗余或抗性。例如，双特异性抗体可以结合相同受体上的两个表位。Jaenichen等人(2009)描述了一种双特异性纳米抗体，其中结构域结合CXCR4上的不同表位。而且已经产生对不同细胞具有两种功能性的双特异性，例如针对癌细胞靶向宿主免疫系统(反式形式)。该方法的最广泛使用的应用是在癌症免疫治疗中，其中已经改造了双特异性抗体，其同时结合细胞毒性细胞(使用受体-样CD3)和要被破坏的靶标如肿瘤细胞。尽管该方法通过破坏癌细胞增加了治疗效果，但是特异性问题仍然存在。本领域的双特异性抗体具体设计为同时结合多个受体激活和下游信号传导通路。将显而易见的是，仅几种病理，例如癌症类型，适用于该方法，因为不是所有疾病或异常细胞，例如恶性细胞过表达促进病理例如恶性疾病的靶标。结合癌细胞表面靶标有时不足以递送有效治疗效果。近期，将细胞毒性化合物与单克隆抗体缀合(称为抗体-药物缀合物或ADC)的观点已经获得了极大的兴趣，以改善效力。对于细胞毒性的有效载荷的靶向递送，由于有效载荷的高毒性，对将肿瘤与正常细胞相区分的靶标的选择甚至比对于功能性阻断抗体的更至关重要。据我们所知，没有在ADC或放射免疫治疗(RIT)中使用双特异性抗体以改善肿瘤选择性的先例。因此，存在改善空间。专利技术概述抗体治疗现在是医生与疾病尤其是癌症作斗争的医疗设备的重要部分。所有同时代存在的批准的抗体治疗依赖于单特异性抗体。然而，这些抗体中的很多的医疗用途严重地受其固有的、系统性毒性影响。该普遍毒性的潜在关键原因是它们的多向性结合模式：抗体结合其不仅在有病细胞，如癌细胞上的本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含第一和第二免疫球蛋白单可变结构域(ISV)的多肽，其中‑所述第一ISV以10nM至200nM之间的平均KD值结合第一靶标；‑所述第二ISV以10nM至0.1pM之间的平均KD值结合第二靶标；并且其中所述第一靶标和所述第二靶标存在于细胞表面上，并且其中所述第一靶标不同于所述第二靶标。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.26 US 61/882,8771.包含第一和第二免疫球蛋白单可变结构域(ISV)的多肽，其中
-所述第一ISV以10nM至200nM之间的平均KD值结合第一靶标；
-所述第二ISV以10nM至0.1pM之间的平均KD值结合第二靶标；并且
其中所述第一靶标和所述第二靶标存在于细胞表面上，并且其中所述第一靶标不同于
所述第二靶标。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述细胞是有病细胞，优选为癌细胞。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽对所述第一靶标具有选自由以下组成
的组的结合速率常数(Kon)：至少约102M-1s-1，至少约103M-1s-1，至少约104M-1s-1，至少约105M
-1s-1，和至少约106M-1s-1，其优选通过表面等离子共振测量。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽对所述第一靶标具有选自由
以下组成的组的解离速率常数(Koff)：至多约10-3s-1，至多约10-4s-1，至多约10-5s-1，和至多
约10-6s-1，其优选通过表面等离子共振测量。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述多肽对所述第一靶标具有选自由
以下组成的组的解离常数(KD)：至多约10-7M，至多约10-8M，至多约10-9M，至多约10-10M，至多
约10-11M，和至多约10-12M，其优选通过表面等离子共振测量。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述第一ISV以10nM至200nM之间的平
均KD值，如10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、或
190nM的平均KD值结合第一靶标，其优选通过SPR测量。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述第一ISV抑制所述第一靶标的功
能。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中所述第一ISV在趋化测定中抑制趋化
作用达约10％、20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％和优选为95％以上。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中所述第一ISV抑制所述细胞的退行性
变化、侵入、转移、增殖、分化、迁移和/或存活。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中所述第一ISV增加所述细胞的凋亡、
细胞杀伤和/或生长停滞。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的多肽，其中所述第二ISV以10nM至0.1pM之间的
平均KD值，如以10nM以下的平均KD值，甚至更优选以9nM以下，如小于8、7、6、5、4、3、2、1、
0.5nM或甚至更小，如小于400、300、200、100、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5pM、
或甚至更小如小于0.4pM的平均KD值结合第二靶标，其优选通过SPR测量。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的多肽，其中所述第二ISV抑制天然配体对所述
第二靶标的结合达小于约50％...

【专利技术属性】
技术研发人员：安内利斯·罗布鲁克，卡特林恩·斯托特勒斯，彼得·万兰德舒特，斯特凡妮·斯塔埃朗，米格尔·孔德，雨果·索尔斯，多米尼克·朔尔斯，
申请(专利权)人：埃博灵克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE