一种香鳞毛蕨愈伤组织的诱导方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种香鳞毛蕨愈伤组织的诱导方法及应用，属于生物技术领域。本发明专利技术所提供的方法为将香鳞毛蕨孢子制备成无菌的孢子悬浮液后接种到改良的Knop′s培养基上，先黑暗处理萌发后进行培养，获得孢子体，将获得的香鳞毛蕨孢子体的茎尖和幼嫩叶片基部作为外植体，接入添加6‑BA和NAA的培养基中进行培养，形成绿色小球体；将绿色小球体或孢子体茎尖接种于含有6‑BA和2,4‑D的培养基中进行增殖分化形成愈伤组织。本发明专利技术方法为建立香鳞毛蕨的快繁体系奠定了理论及实践依据，从而保护了香鳞毛蕨的野生资源，添补了香鳞毛蕨组织培养研究中通过茎尖和幼嫩叶片基部进行愈伤组织诱导的空白。

【技术实现步骤摘要】
一种香鳞毛蕨愈伤组织的诱导方法及应用
本专利技术涉及一种香鳞毛蕨愈伤组织的诱导方法及应用，属于生物

技术介绍
香鳞毛蕨(Dryopterisfragrans(L.)Schott)是鳞毛蕨科鳞毛蕨属植物，主要分布于中国、日本、朝鲜等地，以中国黑龙江省为分布中心，在五大连池地区分布面积较大。香鳞毛蕨主要生长在高寒地区的滑石坡、火山岩浆缝中。王全喜、Momose等对鳞毛蕨科植物的配子体发育进行了大量的研究，但是关于香鳞毛蕨愈伤组织的诱导和再生植株的方法研究尚未见报道。香鳞毛蕨是一种药用植物，对皮肤病具有很好的疗效，具有一定的开发前景，而野生的香鳞毛蕨资源也因其药用价值正遭到严重的破坏。应用蕨类植物孢子进行组织培养，可以建立蕨类植物的快繁体系。在香鳞毛蕨组织培养研究中，由于通过组织培养诱导孢子体的过程周期较长，且野生的香鳞毛蕨在诱导过程中容易产生内生真菌，所以以野生香鳞毛蕨为外植体诱导愈伤很难实现，且愈伤诱导过程中容易产生褐化现象，所以香鳞毛蕨愈伤组织诱导方面尚未报道，并且通过茎尖和幼嫩叶片基部进行愈伤组织诱导也未见报道。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种香鳞毛蕨愈伤组织的诱导方法，采用的技术方案如下：本专利技术的目的在于提供一种香鳞毛蕨愈伤组织的诱导方法，该方法是将香鳞毛蕨孢子制备成无菌的孢子悬浮液后接种到改良的Knop′s培养基上，先黑暗处理萌发后进行培养，获得孢子体，将获得的香鳞毛蕨孢子体的茎尖和幼嫩叶片基部作为外植体，接入添加6-BA和NAA的培养基中进行培养，形成绿色小球体；将绿色小球体和孢子体茎尖接种于含有6-BA和2,4-D的培养基中进行增殖分化形成愈伤组织。优选地，所述方法，步骤如下：1)孢子体的诱导：将香鳞毛蕨的成熟孢子制备成孢子悬浮液后，将孢子悬浮液接种于改良的Knop′s培养基中先黑暗处理同步萌发后进行培养，待长至原叶体阶段将其接种于1/4MS+蔗糖的固体培养基中进行培养，待原叶体长出性器官后将其接种于1/2MS+蔗糖的固体培养基中进行培养，获得孢子体；2)绿色小球体的诱导：将步骤1)获得的香鳞毛蕨孢子体的茎尖或幼嫩叶片基部作为外植体，接入1/2MS+6-BA+NAA+蔗糖的固体培养基中进行诱导培养，获得香鳞毛蕨绿色小球体；3)愈伤组织的诱导和增殖：将步骤2)获得的香鳞毛蕨绿色小球体或步骤1)获得的孢子体的茎尖接入1/2MS+6-BA+2,4-D+蔗糖的固体培养基中培养，形成愈伤组织后加入到1/2MS+蔗糖的固体培养基进行分化培养，获得香鳞毛蕨愈伤组织。优选地，所述培养基，pH值为5.7-5.8.优选地，所述培养，温度为25±2℃，光照12h，黑暗12h，光强150μmol·m-2·s-1-180μmol·m-2·s-1。优选地，步骤1)所述改良的Knop′s培养基，含有NaH2PO40.25g，KNO30.25g，MgSO40.25g，Ca(NO3)21.0g和蒸馏水1000mL。优选地，步骤1)所述1/4MS+蔗糖的固体培养基，为1/4MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基。优选地，步骤1)所述1/2MS+蔗糖的固体培养基，为1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基。优选地，步骤2)所述6-BA，浓度为0.5mg/L-2.0mg/L；所述NAA，浓度为0.5mg/L-5.0mg/L。优选地，步骤3)所述6-BA，浓度为0.5mg/L-2.0mg/L。优选地，步骤3)所述2,4-D，浓度为0.5mg/L-1.5mg/L。优选地，步骤3)所述1/2MS+蔗糖的固体培养基，为1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基。优选地，所述方法，步骤如下：1)孢子体的诱导：将香鳞毛蕨的成熟孢子制备成孢子悬浮液后，将孢子悬浮液接种于改良的Knop′s培养基中先黑暗处理同步萌发后进行培养，待长至原叶体阶段将其接种于1/4MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中进行培养，待原叶体长出性器官后将其接种于1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中进行培养，获得孢子体；2)绿色小球体的诱导：将步骤1)获得的香鳞毛蕨孢子体的茎尖或幼嫩叶片基部作为外植体，接入1/2MS+0.5mg/L～2.0mg/L6-BA+0.5mg/L～5.0mg/LNAA+2.0％蔗糖的固体培养基中进行诱导培养，获得香鳞毛蕨绿色小球体；3)愈伤组织的诱导和增殖：将步骤2)获得的香鳞毛蕨绿色小球体或步骤1)获得的孢子体的茎尖接入1/2MS+0.5mg/L～2.0mg/L6-BA+0.5mg/L～1.5mg/L2,4-D+2.0％蔗糖的固体培养基中培养，形成愈伤组织后加入到1/2MS+3.0％蔗糖的固体培养基进行分化培养，获得香鳞毛蕨愈伤组织。更优选地，所述方法，具体步骤为：1)孢子体的诱导：将香鳞毛蕨的成熟孢子制备成孢子悬浮液后，将孢子悬浮液接种于改良的Knop′s培养基中先黑暗处理同步萌发后进行培养，待长至原叶体阶段将其接种于1/4MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中进行培养，待原叶体长出性器官后将其接种于1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中进行培养，每隔3天向培养基里加入无菌水，每隔3-5周继带一次，80d后获得孢子体；所述改良的Knop′s培养基，含有NaH2PO40.25g，KNO30.25g，MgSO40.25g，Ca(NO3)21.0g和蒸馏水1000mL；2)绿色小球体的诱导：将步骤1)获得的香鳞毛蕨孢子体的茎尖或幼嫩叶片基部作为外植体，接入1/2MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+2.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中进行诱导培养，获得香鳞毛蕨绿色小球体；3)愈伤组织的诱导和增殖：将步骤2)获得的香鳞毛蕨绿色小球体或步骤1)获得的孢子体茎尖接入1/2MS+0.5mg/L6-BA+1.5mg/L2,4-D+2.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂培养基中培养形成愈伤组织，然后加入到1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中进行分化培养，3-4周继代一次；所述培养，温度为25±2℃，光照12h，黑暗12h，光强150～180μmol·m-2·s-1；所述培养基，pH值为5.7-5.8。以上所述任一方法在香鳞毛蕨的愈伤组织培养、无性繁殖以及建立快速繁殖体系中的应用。本专利技术有益效果：本专利技术方法克服了通过组织培养诱导孢子体的过程周期较长，且野生的香鳞毛蕨在诱导过程中容易产生内生真菌的问题，实现了以组培香鳞毛蕨孢子体为外植体诱导愈伤，并且降低了愈伤诱导过程中容易产生褐化的现象。本文通过对香鳞毛蕨不同部位诱导产生愈伤组织,为建立香鳞毛蕨的快繁体系奠定了理论及实践依据,从而保护了香鳞毛蕨的野生资源。并且在香鳞毛蕨组织培养研究中，通过茎尖和幼嫩叶片基部进行愈伤组织诱导未见报道。愈伤组织可研究植物生长发育及分化的机制并对蕨类遗传转化具有特殊意义。利于缓解对现有蕨类植物需求的压力，保存蕨类植物种质资源。有助于探讨和阐明蕨类植物生理、遗传等一系列理论问题。因此，蕨类植物组织培养还有待于进一步的研究和探索。附图说明图1为通过野生孢子诱导形成香鳞毛蕨幼苗。图2为香鳞毛蕨茎尖。图3为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种香鳞毛蕨愈伤组织的诱导方法，其特征在于，将香鳞毛蕨孢子制备成无菌的孢子悬浮液后接种到改良的Knop′s培养基上，先黑暗处理萌发后进行培养，获得孢子体，将获得的香鳞毛蕨孢子体的茎尖和幼嫩叶片基部作为外植体，接入添加6‑BA和NAA的培养基中进行培养，形成绿色小球体；将绿色小球体或孢子体的茎尖接种于含有6‑BA和2,4‑D的培养基中进行增殖分化形成愈伤组织。

【技术特征摘要】
1.一种香鳞毛蕨愈伤组织的诱导方法，其特征在于，步骤如下：1)孢子体的诱导：将香鳞毛蕨的成熟孢子制备成孢子悬浮液后，将孢子悬浮液接种于改良的Knop′s培养基中先黑暗处理同步萌发后进行培养，待长至原叶体阶段将其接种于1/4MS+蔗糖的固体培养基中进行培养，待原叶体长出性器官后将其接种于1/2MS+蔗糖的固体培养基中进行培养，获得孢子体；所述改良的Knop′s培养基，含有NaH2PO40.25g，KNO30.25g，MgSO40.25g，Ca(NO3)21.0g和蒸馏水1000mL；2)绿色小球体的诱导：将步骤1)获得的香鳞毛蕨孢子体的茎尖作为外植体，接入1/2MS+6-BA+NAA+蔗糖的固体培养基中进行诱导培养，获得香鳞毛蕨绿色小球体；所述6-BA，浓度为0.5mg/L-2.0mg/L；所述NAA，浓度为0.5mg/L-5.0mg/L；3)愈伤组织的诱导和增殖：将步骤2)获得的香鳞毛蕨绿色小球体或步骤1)获得的孢子体的茎尖接入1/2MS+6-BA+2,4-D+蔗糖的固体培养基中培养，形成愈伤组织后加入到1/2MS+蔗糖的固体培养基进行分化培养，获得香鳞毛蕨愈伤组织；所述6-BA，浓度为0.5mg/L-2.0mg/L；所述2,4-D，浓度为0.5mg/L-1.5mg/L。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述1/4MS+蔗糖的固体培养基，为1/4MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基；所述1/2MS+蔗糖的固体培养基，为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：常缨，卜志刚，陈玲玲，佟伟霜，黄庆阳，陶文青，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23