一种用于基因纯化的装置及纯化方法制造方法及图纸

本发明专利技术提供一种用于基因纯化的装置，所述装置包括吸头、套筒、筛板和推杆，吸头与套筒前端紧密贴合，筛板为与套筒内壁横截面大小配合的圆片状，筛板、推杆依次置于套筒内部，并分别与套筒内侧壁紧密贴合。在筛板与套筒前端之间，放置有吸附材料。本发明专利技术还提供应用该装置进行基因纯化的方法。本发明专利技术利用实验室常规耗材及药品实现了细菌基因组及质粒、PCR Clean以及胶回收的低成本、高效率纯化；且整个提取过程不添加任何有毒有机溶剂。本发明专利技术的装置制作方法和操作方法简单，可循环使用，降低了成本。清洗及洗脱过程无需使用离心机，且洗脱之前无需晾干挥发乙醇，节省了时间。装置规格种类多，可进行微量及大批量操作。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于基因纯化的装置及纯化方法。
技术介绍
质粒被作为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要载体，它可以把目的DNA片段通过重组DNA技术，导入受体细胞中去进行复制和表达。因此质粒提取的质量对后续的分子生物学实验的成败起着关键的作用。目前许多国内外公司都研发和提供了质粒提取试剂盒，但这些试剂盒提取质粒时，需要经过繁琐的步骤，耗时长。且试剂盒中采用许多有毒化学物质，即污染环境又会威胁到操作者的健康。目前提取细菌质粒DNA的方法主要有：1.酚-氯仿-异戊醇抽提；2.离心柱型质粒提取；3.磁珠法质粒提取；4.基于DEAE的重力柱法质粒提取。以上四种方法各有缺陷。第一种方法含对人体有毒的有机溶剂，操作危险；第二种方法需要多次使用离心机，操作繁琐，提取过程中有晾干挥发乙醇步骤，增加了时间耗费；第三种方法磁珠易被氧化，且磁力、吸附量与磁珠大小、比表面积成比例，比表面积大，则吸附量高，体积小，磁力小，不易吸附到磁力架上，消耗时间长；第四种方法成本较高，依靠重力作用让液体流过柱子，流速慢，耗时长，洗脱体积大，盐离子浓度高，最后需对产物浓缩。基因组DNA制备是分子生物学研究的关键技术，细菌样品中DNA的提取效率和质量对后续研究极其重要。所提取DNA的浓度、纯度及片段大小，对后续PCR、克隆的效果产生了一定影响。理想的基因组DNA提取方法不但要考虑DNA提取得率，还要尽可能地保证DNA的纯度。目前常用的微生物基因组纯化方法主要有碱裂解法、酚-氯仿法等。这些方法普遍存在产物不纯、操作繁琐等问题,且无法摆脱对高速离心机的依赖。PCRClean作为对PCR产物纯化的一种方法，其纯化效率直接影响到下步酶切反应的进行，纯化效率低会导致整个转化效率过低。胶回收是对基因片段选择性回收的主要方法，其本身回收体系较为有限且常规溶胶液对基因损伤较大，对回收率及纯度要求更高。
技术实现思路
为了解决在基因纯化过程中目前存在的使用有毒有机溶剂、多次使用离心机，操作繁琐、提取时间过长、成本高等问题，本专利技术提供了一种基因纯化方法。本专利技术的方法操作简便，无需多次离心，节约时间、可重复使用，节约成本、可实现大批量提取、不添加任何有毒有机溶剂。本专利技术利用实验室常规耗材及药品实现了细菌基因组及质粒、PCRClean以及胶回收的低成本、高效率纯化。本专利技术的第一个目的是提供一种用于基因纯化的装置，所述装置包括吸头、套筒、筛板和推杆，吸头与套筒前端紧密贴合，筛板为与套筒内壁横截面大小配合的圆片状，筛板、推杆依次置于套筒内部，并分别与套筒内侧壁紧密贴合。在筛板与套筒前端之间，放置有吸附材料。作为优选，所述吸附材料为SiO2粉末；作为优选，所述SiO2粉末的粒径为20-80μm。作为优选，所述装置的规格为2.5ml、5ml、10ml、20ml、50ml、100ml或300ml。作为优选，所述装置的容积与SiO2的用量比为：2.5ml：0.1g或2.5ml：0.05g。本专利技术的第二个目的是提供应用上述装置提取细菌质粒DNA的方法，当所述装置的规格为2.5ml时，提取细菌质粒DNA的步骤如下：(1)将革兰氏阴性菌扩大培养后，取1-6ml菌液，离心弃上清；(2)加200μl细胞悬浮液以悬浮步骤1中的细菌；(3)向步骤(2)的细胞悬浮液中加入200μl细胞裂解液，温和颠倒混匀2-3次，此时溶液应变为澄清，步骤(3)操作时间不超过1分钟；(4)向步骤(3)的溶液中加300μl质粒结合液，温和颠倒混匀3-5次，12000rpm离心5-8分钟；(5)用权利要求1-4任一所述的装置吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干；装置中，SiO2粉末的质量为0.1g；(6)拉动推杆将步骤(4)中的离心上清吸入权利要求1或2所述的装置中，上下颠倒混匀3-5次，推动推杆挤出液体；(7)拉动推杆吸入500μl去蛋白液，上下颠倒2-3次，挤出液体；(8)拉动推杆吸入500μl洗涤液1，上下颠倒2-3次，挤出液体；(9)重复步骤(7)一次；(10)拉动推杆吸入400μl洗涤液2，迅速混匀挤出液体；(11)拉动推杆吸入50-300μl洗脱液，静置1-2min，期间每10s颠倒混匀一次，将液体挤到新的容器中，获得质粒；其中，步骤(2)中所述细胞悬浮液的配方为：50mmol/LTris，10mmol/LEDTA，1-10μg/mLRNaseA；以超纯水为溶剂，pH6.0-9.0；步骤(3)中所述细胞裂解液的配方为：0.05-1.5mol/LNaOH，质量体积百分比为1％-3％的SDS；以超纯水为溶剂；步骤(4)中所述质粒结合液的配方为：2-6mol/LGuHCl，0.01-1mol/LCH3COOK；以超纯水为溶剂，pH3-5；步骤(7)中所述去蛋白液的配方为：2-6mol/LGuHCl，100mmol/LTris，20mmol/LEDTA，体积百分比10％-30％的异丙醇；以超纯水为溶剂，pH6-8；步骤(8)中所述洗涤液1的配方为：体积百分比30％-90％乙醇；步骤(10)中所述洗涤液2的配方为：ddH2O；步骤(11)中所述洗脱液的配方为：10mmol/LTris，1mmol/LEDTA；以超纯水为溶剂，pH7-12。本专利技术的第三个目的是提供应用上述装置提取细菌基因组DNA的方法，所述装置的规格为2.5ml时，提取细菌基因组DNA的步骤如下：(1)将细菌扩大培养后，取0.5-1ml菌液，离心弃上清；(2)加200μl细胞悬浮液以悬浮步骤(1)中的细菌；(3)若为革兰氏阴性菌：向步骤(2)的细胞悬浮液中加入200μl细胞裂解液，10μl浓度为20mg/ml蛋白酶K，温和颠倒混匀2-3次，37℃水浴10min；若为革兰氏阳性菌：向步骤(2)的细胞悬浮液中加入10μl浓度为100mg/ml的溶菌酶，37℃水浴30min；(4)向步骤(3)的溶液中加200μl中和液，上下颠倒2-3次；(5)用权利要求1-4任一所述的装置吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干；装置中，SiO2粉末的质量为0.1g；(6)拉动推杆将步骤(4)中的液体全部吸入套筒中，静置1min，期间每10s颠倒混匀一次，推动推杆挤出液体；(7)拉动推杆吸入500μl去蛋白液，上下颠倒2-3次，挤出液体；(8)拉动推杆吸入500μl洗涤液1，上下颠倒2-3次，挤出液体；(9)重复步骤(7)一次；(10)拉动本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于基因纯化的装置，其特征在于：所述装置包括吸头(4)、套筒(1)、筛板(3)和推杆(2)，吸头(4)与套筒(1)前端紧密贴合，筛板(3)为与套筒内壁横截面大小配合的圆片状，筛板(3)、推杆(2)依次置于套筒(1)内部，并分别与套筒(1)内侧壁紧密贴合。在筛板(3)与套筒(1)前端之间，放置有吸附材料。

【技术特征摘要】
1.一种用于基因纯化的装置，其特征在于：所述装置包括吸头(4)、套筒(1)、筛板(3)
和推杆(2)，吸头(4)与套筒(1)前端紧密贴合，筛板(3)为与套筒内壁横截面大小
配合的圆片状，筛板(3)、推杆(2)依次置于套筒(1)内部，并分别与套筒(1)内侧
壁紧密贴合。在筛板(3)与套筒(1)前端之间，放置有吸附材料。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述吸附材料为SiO2粉末；作为优选，所
述SiO2粉末的粒径为20-80μm。
3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述装置的规格为2.5ml、5ml、10ml、20ml、
50ml、100ml或300ml。
4.根据权利要求1-3任一所述的装置，其特征在于：所述装置的容积与SiO2的用量比为：
2.5ml：0.1g或2.5ml：0.05g。
5.应用权利要求1-4任一所述的装置提取细菌质粒DNA的方法，其特征在于：所述装置
的规格为2.5ml时，提取细菌质粒DNA的步骤如下：
(1)将革兰氏阴性菌扩大培养后，取1-6ml菌液，离心弃上清；
(2)加200μl细胞悬浮液以悬浮步骤1中的细菌；
(3)向步骤(2)的细胞悬浮液中加入200μl细胞裂解液，温和颠倒混匀2-3次，此时
溶液应变为澄清，步骤(3)操作时间不超过1分钟；
(4)向步骤(3)的溶液中加300μl质粒结合液，温和颠倒混匀3-5次，12000rpm离
心5-8分钟；
(5)用权利要求1-4任一所述的装置吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干；装置中，
SiO2粉末的质量为0.1g；
(6)拉动推杆将步骤(4)中的离心上清吸入权利要求1或2所述的装置中，上下颠倒混
匀3-5次，推动推杆挤出液体；
(7)拉动推杆吸入500μl去蛋白液，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(8)拉动推杆吸入500μl洗涤液1，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(9)重复步骤(7)一次；
(10)拉动推杆吸入400μl洗涤液2，迅速混匀挤出液体；
(11)拉动推杆吸入50-300μl洗脱液，静置1-2min，期间每10s颠倒混匀一次，将
液体挤到新的容器中，获得质粒；
其中，步骤(2)中所述细胞悬浮液的配方为：50mmol/LTris，10mmol/LEDTA，1-10μg/mL
RNaseA；以超纯水为溶剂，pH6.0-9.0；
步骤(3)中所述细胞裂解液的配方为：0.05-1.5mol/LNaOH，质量体积百分比为1％-3％
的SDS；以超纯水为溶剂；
步骤(4)中所述质粒结合液的配方为：2-6mol/LGuHCl，0.01-1mol/LCH3COOK；以超
纯水为溶剂，pH3-5；
步骤(7)中所述去蛋白液的配方为：2-6mol/LGuHCl，100mmol/LTris，20mmol/LEDTA，
体积百分比10％-30％的异丙醇；以超纯水为溶剂，pH6-8；
步骤(8)中所述洗涤液1的配方为：体积百分比30％-90％乙醇；
步骤(10)中所述洗涤液2的配方为：ddH2O；
步骤(11)中所述洗脱液的配方为：10mmol/LTris，1mmol/LEDTA；以超纯水为溶剂，
pH7-12。
6.应用权利要求1-4任一所述的装置提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于：所述装
置的规格为2.5ml时，提取细菌基因组DNA的步骤如下：
(1)将细菌扩大培养后，取0.5-1ml菌液，离心弃上清；
(2)加200μl细胞悬浮液以悬浮步骤(1)中的细菌；
(3)若为革兰氏阴性菌：向步骤(2)的细胞悬浮液中加入200μl细胞裂解液，10μl
浓度为20mg/ml蛋白酶K，温和颠倒混匀2-3次，37℃水浴10min；
若为革兰氏阳性菌：向步骤(2)的细胞悬浮液中加入10μl浓度为100mg/ml的溶
菌酶，37℃水浴30min；
(4)向步骤(3)的溶液中加200μl中和液，上下颠倒2-3次；
(5)用权利要求1-4任一所述的装置吸取ddH2O1-2ml清洗2-3次，挤干；装置中，
SiO2粉末的质量为0.1g；
(6)拉动推杆将步骤(4)中的液体全部吸入套筒中，静置1min，期间每10s颠倒混
匀一次，推动推杆挤出液体；
(7)拉动推杆吸入500μl去蛋白液，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(8)拉动推杆吸入500μl洗涤液1，上下颠倒2-3次，挤出液体；
(9)重复步骤(7)一次；
(10)拉动推杆吸入400μl洗涤液2，迅速混匀挤出液体；
(11)拉动推杆吸入50-300μl洗脱液，静置1-2min，期间每10...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛正莲，杨建伟，朱昊，王洲，刘艳，费芙蓉，吴爽，彭凡，袁红梅，
申请(专利权)人：安徽工程大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34