一种快速准确筛选微生物中生物学活性物质的方法技术

本发明专利技术提供了一种在微生物中筛选具有生物学活性的物质的方法，步骤是：(1)筛选出表观型相似，且生物学活性有差异的多株微生物；(2)通过HPLC化学分离鉴定，定位微生物发酵提取物中的关键差异物质；(3)分离纯化所述关键差异物质；(4)进行所述关键差异物质的生物学活性鉴定；(5)进行所述关键差异物质的化学结构鉴定。本方法以生物活性筛选和化学分离鉴定为基础，以活性差异为切入点，可以快速、方便筛选到关键的生物学活性物质。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化学
，涉及一种快速准确筛选微生物中具有生物学活性的物质的方法。特别是涉及一种快速准确筛选曲霉属中抗生素的方法。
技术介绍
一株活性微生物菌株可以产生大量次级代谢产物，现代分离技术可以轻易从发酵液中分离得到几十种组份；另外，从激增的基因组数据中发现了大量次级代谢产物基因，也表明可能有大量活性物质没有被挖掘出来。因此，从成份复杂的微生物次级代谢产物中快速准确的定位某种活性物质，是充分利用微生物资源的关键。建立快速、方便的生物学活性物质筛选模型，寻找其中最主要和最重要的活性组份，将对活性物质的筛选起着决定性作用。现有技术主要是通过化学分离的方法筛选得到活性物质。首先从自然界中分离筛选活性物质产生菌，从大量待筛选微生物中鉴别出有实用价值的活性物质产生菌，大规模培养活性微生物，分离纯化各个组分或化合物，再分析各个组分或化合物的生物学活性，达到筛选活性物质的目的。该方法筛选过程耗时长，人工成本高，筛选效率低，不能快速准确锁定其中主要的活性物质。因此，开发一种可以快速准确寻找到微生物中主要发挥生物学活性的物质的方法，非常必要。已知多种曲霉属真菌次级代谢产物具有重要生物学活性，比如，胆固醇合成抑制剂洛伐他汀lovastatin，致癌物黄曲霉毒素aflatoxins，植物性毒素terrein等，都是曲霉属的次级代谢产物。曲霉属真菌次级代谢产物往往具有多种生物活性和/或新颖的结构,在农业和/或医药业中具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种在表观型相似、生物学活性不同的微生物中，快速准确筛选生物学活性物质的方法。科研工作者在进行微生物次级代谢产物活性的研究过程中发现，即使是表观型相似的相同种属的微生物，也会具有不同的次级代谢产物谱，这可能和微生物所处的外界生长环境有关。本专利技术利用这个差异，建立了一种快速准确筛选具有生物学活性物质的方法，达到了上述专利技术目的。本专利技术的技术方案如下一种在多个表观型相似、生物学活性不同微生物中筛选到具有生物学活性的物质的方法，其特征是：(1)筛选出表观型相似，且生物学活性有差异的多株微生物；(2)通过HPLC化学分离鉴定，定位到微生物发酵提取物中的关键差异物质；(3)分离纯化所述关键差异物质；(4)进行所述关键差异物质的生物学活性鉴定；(5)进行所述关键差异物质的化学结构鉴定。上述步骤(2)是分别对表观型相似生物学活性有差异的多株微生物进行发酵提取，采用HPLC方法，分别对每种发酵提取物进行化学分离鉴定，分析各自的色谱图；所述关键差异物质是通过色谱峰推断提取物中的可能具有生物活性的某化合物。所述多株，为2株或2株以上。上述步骤(3)，所述分离纯化可采用各种化学分离纯化方法，包括采用半制备色谱柱层析、中压色谱柱层析等方法；使用正相硅胶、反相硅胶、树脂、凝胶、氧化铝等分离材料。上述步骤(4)中，所述生物学活性，包括抗生素活性或抗肿瘤活性等。在抗生素活性筛选中，可根据实验需要选用抗生素测试菌株。在本专利技术的一个实施例中，选取了短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、大肠杆菌和青枯菌，用于抗生素活性的筛选。在实践中，还可选取其它相应的细菌、真菌、病毒等来完成相应的筛选实验。上述步骤(5)，可根据需要，选用质谱和核磁共振、红外、紫外等波谱学技术鉴定化合物的结构；本专利技术的有益效果本方法以生物活性筛选和化学分离鉴定为基础，以微生物的某些重要生物学活性为研究目标，以活性差异为切入点，快速准确、方便的筛选到关键的生物学活性物质。本专利技术用以下实验证实了上述方法可成功用于快速准确、方便地从表观型相似、抑菌活性有差异的三株曲霉属菌株中筛选到具有抗生素活性的主要成分：对表观型相似的三株微生物进行固体发酵，将发酵物的甲醇提取物进行抗生素生物活性筛选，其中两株真菌表现出良好的抗细菌活性，分别对三个提取物进行HPLC分析，发现三者具有不同的液相色谱图谱，分析色谱峰推断化合物3可能为具有抗生素活性的主要成分，采用半制备型HPLC分离纯化该化合物，质谱和核磁共振等波谱学技术鉴定其结构，确定化合物为ButyrolactoneI，18SrDNA分析这三株微生物均为曲霉属。为了确认是否是该化合物发挥抗细菌活性，也为了确认该方法是否准确，我们应用纯化的化合物3再一次进行抗生素生物活性鉴定，明确了该化合物能够抑制细菌生长，也验证了该方法的准确性。具体详见实施例。本研究所进行的筛选抗生素的方法，也可应用于其他天然资源，寻找具有其他生物活性的物质。附图说明图1是三株曲霉属菌株发酵提取物的HPLC图谱及抑菌圈图。具体实施方式在本专利技术的以下实施例中，以快速准确筛选表观型相似、抑菌活性有差异的三株曲霉属菌株(分别命名为YSN038、YSN052和YSN064)中的抗菌物质作为举例。实际上，本专利技术所建立的方法也可以快速准确筛选其他表观型相似、生物学活性有差异的微生物菌株中生物学活性物质。实施例1表观型相似、抑菌活性有差异的三株菌株的抗生素生物活性筛选在大量筛选微生物菌株抗生素活性实验中，我们发现了三株来源于新疆的表观型相似，但抑菌活性有差异的菌株，命名为YSN038、YSN052和YSN064。它们在形态学上均呈淡褐色或褐色，老后呈赭茶褐色，质地致密绒毛状，平坦或有放射状沟纹，中央部分稍凸起，有的菌株稍现絮状。但是三者在形态学上也有一定的差异，比如YSN038、YSN064菌株孢子比较分散，YSN052菌株孢子与前两者相比较密实。YSN038、YSN064的发酵液提取物可以抑制某些细菌的生长，但是YSN052发酵液提取物对同样的细菌完全没有抑制活性。YSN038、YSN052、YSN064菌株分别用五个PDA固体平板培养，提取到的粗提物质量分别为0.31g、0.25g、0.26g。纸片扩散法鉴定三个提取物抗细菌活性，提取物浓度为80μg/片。结果显示，YSN038、YSN064提取物可抑制短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌的生长，但是对大肠杆菌和青枯菌没有抑制活性(测试菌株及菌株号见表1)。其抑制活性大小为：短小芽孢杆菌>枯草芽孢杆菌>金黄色葡萄球菌>藤黄微球菌，抑菌圈大小为13.2mm,13mm,11.2mm和10.2mm。而YSN052提取物对以上6种细菌的生长完全没有抑制活性(见表2)。表1抗生素活性实验的测试菌株名称及菌株号测试菌株名称备注金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ATCC10626大肠杆菌(Escherichiacoli)MG1655藤黄微球菌(Kocuriarhizophila)CGMCC1.2156短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)CGMCC1.3533青枯菌(Ralstoniasolanacearum)ACCC11608表2YSN038、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在微生物中筛选具有生物学活性物质的方法，步骤是：(1)筛选出表观型相似，且生物学活性有差异的多株微生物；(2)通过HPLC化学分离鉴定，定位到微生物发酵提取物中的关键差异物质；(3)分离纯化所述关键差异物质；(4)进行所述关键差异物质的生物学活性鉴定；(5)进行所述关键差异物质的化学结构鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种在微生物中筛选具有生物学活性物质的方法，步骤是：
(1)筛选出表观型相似，且生物学活性有差异的多株微生物；
(2)通过HPLC化学分离鉴定，定位到微生物发酵提取物中的关键差异物质；
(3)分离纯化所述关键差异物质；
(4)进行所述关键差异物质的生物学活性鉴定；
(5)进行所述关键差异物质的化学结构鉴定。
2.权利要求1所述的方法，所述关键差异物质是通过分析微生物发酵提取物的色谱
峰推断出的生物活性物质；所述多株，为2株或2株以上。
3.权利要求1所述的方法，其中步骤(2)是分别对表观型相似生物学活性有差异的
几株微生物进行发酵提取，并采用HPLC方法对所得的每种发酵提取物进行化学分离鉴定，
分析各自的色谱图。
4.权利要求1所述的方法，其中步骤(3)所述分离纯化，为各种化学分离纯化方法
及材料，包括采用半制备色谱柱层析或中压色谱柱层析方法；使用的分离材料选自...

【专利技术属性】
技术研发人员：张礼文，王晓婧，杨胜男，白净，谢李楠，刘航，徐玉泉，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11