低聚半乳糖的检测定量方法技术

提供从含低聚半乳糖和糊精的试样中简单地以低成本分离4′-GL并对4′-GL和低聚半乳糖正确地进行定量的方法。该方法对含低聚半乳糖和糊精的试样中的低聚半乳糖进行检测定量，所述低聚半乳糖的检测定量方法的特征在于，使所述试样与衍生物化试剂反应，使试样中的糊精和低聚半乳糖衍生物化，接着通过使用C30反相色谱柱的高效液相色谱将该试样中的低聚半乳糖成分分离。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及对含低聚半乳糖和糊精的试样中的低聚半乳糖进行检测定量的方法。
技术介绍
低聚半乳糖是以半乳糖为主要成分的结合方式不同的寡糖的混合物，一般，通过在乳糖中进行基于β-半乳糖苷酶的转移反应而制造。作为低聚半乳糖的生理效果，被报道了使在肠道内生存的乳酸杆菌增加来调理肠内环境的效果、通过减少肠间膜脂肪而有助于预防生活习惯病等效果，作为特定保健用食品、各种功能性食品或者它们的原材料，从以前开始就被重视。在作为特定保健用食品等的成分使用低聚半乳糖的情况下，为了保证其品质、规格、对作为功能性成分的定量分析数据进行表示等，要求确立正确性高的定量法。对饮食品中的低聚半乳糖进行定量的方法有如下方法：使β-半乳糖苷酶作用于低聚半乳糖，对由酶解产生的半乳糖进行定量，算出寡糖(非专利文献1)。但是，生成的半乳糖的检测需要使用安装有昂贵的脉冲型电化学检测器的阴离子交换高效液相色谱，有通用性低的问题。另外，在饮食品中含乳糖等营养成分的情况下，不能对由酶处理产生的半乳糖和从乳糖游离的半乳糖进行判断，结果是，低聚半乳糖的定量精度下降。也存在如下方法：对低聚半乳糖中的特征性成分、例如4′-半乳糖基乳糖(4′-GL；Galβ1-4Galβ1-4Glc)进行定量，根据其量进行逆运算，算出低聚半乳糖的总量。该方法可判明使用的低聚半乳糖中的4′-GL的含量，在该含量稳定而没有批次差异等的情况下特别有效。作为对饮食品试样中的4′-GL进行定量的方法，以往主要使用如下方法：利用凝胶渗透色谱，根据分子的尺寸将饮食品中的其他成分和4′-GL分离。但是，如上所述，低聚半乳糖大多使用营养成分丰富的饮食品、例如育儿用调制奶粉、发酵乳制品等作为功能性的原材料，在该饮食品中也大多含分子的大小与4′-GL同等的糖质源，所以在凝胶渗透色谱中不能将那些糖质源和4′-GL分离。例如，在想要用凝胶渗透色谱对含作为糊精所含的一种糖类的麦芽三塘的饮食品中的4′-GL进行分离和定量的情况下，因为麦芽三塘和4′-GL的分子大小相同，所以从柱洗脱后的两者的峰重合，因此给4′-GL的定量、即低聚半乳糖的定量带来障碍。作为用反向色谱检测寡糖的方法，已知使用C8或者C18反相色谱柱的方法(专利文献1)。但是，在使用这些柱尝试进行饮食品中的低聚半乳糖的分离的情况下，不能将饮食品的其他成分和低聚半乳糖成分分离。现有技术文献专利文献专利文献1：特表2007-523352号公报非专利文献非专利文献1：JournalofAOACInternational，Volume85，Number2，March2002，pp.417-423(7)
技术实现思路
因此，本专利技术的目的在于：提供从含低聚半乳糖和糊精的试样中简单且低成本地分离4′-GL并对4′-GL和低聚半乳糖正确地进行定量的方法。本专利技术人为了解决上述问题进行了锐意研究，结果发现：通过使含低聚半乳糖和糊精的试样与衍生物化试剂反应，使所述试样中的糊精和低聚半乳糖衍生物化，接着，提供于使用C30反相色谱柱的高效液相色谱，从而能将该试样中的低聚半乳糖成分充分分离，由此完成了本专利技术。即，本专利技术提供低聚半乳糖的检测定量方法，其对含低聚半乳糖和糊精的试样中的低聚半乳糖进行检测定量，所述低聚半乳糖的检测定量方法的特征在于，使所述试样与衍生物化试剂反应，使试样中的糊精和低聚半乳糖衍生物化，接着通过使用C30反相色谱柱的高效液相色谱将该试样中的低聚半乳糖成分分离。根据本专利技术的检测定量方法，能简单地以低成本将试样中的低聚半乳糖和其他成分分离，能正确地进行低聚半乳糖的定量。通过使用本专利技术的方法对饮食品等的低聚半乳糖进行检测定量，能对该饮食品等所含的低聚半乳糖的量正确地进行管理，能保证品质，并且能正确地进行各种有效性试验数据的取得、表示等。附图说明图1是使用凝胶渗透柱的HPLC的色谱图。图2是PMP衍生物反相HPLC色谱图(C30)。图3是PMP衍生物-反相HPLC色谱图(C18反相柱)。图4是PMP衍生物-反相HPLC色谱图(C8反相柱)。图5是PMP衍生物反相HPLC色谱图(C30)，磷酸钾缓冲液(pH4)/CH3CN(78/22)。图6是PMP衍生物反相HPLC色谱图(C30)，磷酸钾缓冲液(pH5)/CH3CN(79/21)。图7是PMP衍生物反相HPLC色谱图(C30)，磷酸钾缓冲液(pH7)/CH3CN(81/19)。图8是PMP衍生物反相HPLC色谱图(C30)，磷酸钾缓冲液(pH7)/CH3CN(82/18)。图9是PMP衍生物反相HPLC色谱图(C30)，磷酸钾缓冲液(pH8)/CH3CN(82/18)。图10是PMP衍生物反相HPLC色谱图(C30)，磷酸钾缓冲液(pH8)/CH3CN(83/17)。图11是PMP衍生物反相HPLC色谱图(C30)。具体实施方式本专利技术的检测定量方法是如下方法：在使饮食品等试样中所含的低聚半乳糖衍生物化的基础上提供于使用C30反相色谱柱的高效液相色谱(HPLC)，对试样中的其他成分和低聚半乳糖进行分离和定量。低聚半乳糖用通式：Gal-(Gal)n-Glc(其中，式中Gal是半乳糖残基，Glc是葡萄糖残基，n是0～4的整数)表示，是在分子内含一分子以上半乳糖的2～6糖的混合物。其中，乳糖不含于低聚半乳糖中。低聚半乳糖的主要成分是在乳糖的非还原末端键合有1个半乳糖的3糖的4′-半乳糖基乳糖(4′-GL)。作为其他的具体成分，可列举Galβ1-3Glc、Galβ1-2Glc、Galβ1-6Glc、Galβ1-6Galβ1-4Glc、Galβ1-6Galβ1-4Galβ1-4Glc、Galβ1-4Galβ1-4Galβ1-4Glc等。在本发明的检测定量方法中，可以将低聚半乳糖作为混合物对其进行检测定量，也可以对各个低聚半乳糖成分进行检测定量，但是从定量的精度的方面出发，优选在以4′-GL为对象将其分离后进行检测定量，根据其量进行逆运算，算出低聚半乳糖的总量。低聚半乳糖以任何方法得到均可，例如，能使用以乳糖为原料，通过基于乳糖分解酶(β-半乳糖苷酶)的转移反应而制成的低聚半乳糖。也可以在转移反应中，使产生酶的微生物作用于原料。作为含乳糖的原料，例如可列举市售的乳糖、乳汁、奶粉、干酪本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低聚半乳糖的检测定量方法，其对含低聚半乳糖和糊精的试样中的低聚半乳糖进行检测定量，所述低聚半乳糖的检测定量方法的特征在于，使所述试样与衍生物化试剂反应，使试样中的糊精和低聚半乳糖衍生物化，接着通过使用C30反相色谱柱的高效液相色谱将该试样中的低聚半乳糖成分分离。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.30 JP JP2013-2055031.一种低聚半乳糖的检测定量方法，其对含低聚半乳糖和糊精
的试样中的低聚半乳糖进行检测定量，所述低聚半乳糖的检测定量
方法的特征在于，使所述试样与衍生物化试剂反应，使试样中的糊
精和低聚半乳糖衍生物化，接着通过使用C30反相色谱柱的高效液
相色谱将该试样中的低聚半乳糖成分分离。
2.根据权利要求1所述的低聚半乳糖的检测定量方法，其特征
在于，作为在高效液相色谱中使用的洗脱液，使用缓冲液和极性有
机溶剂的混合液。
3.根据权利要求2所述的低聚半乳糖的检测定量方法，其特征
在于，作为所述缓冲液使用Ph5～6的缓冲液。
4.根据权利要求2或3所述的低聚半乳糖的检测定量方法，其
特征在于，所述混合液的缓冲液和极性有机溶剂的混合比(vol/vol)
是缓冲液/极性有机溶剂＝79/21～80/20。
5.根据权利要求2～4中的任一项所述的低聚半乳糖的检测定...

【专利技术属性】
技术研发人员：水越晴美，木村一雅，
申请(专利权)人：株式会社养乐多本社，
类型：发明
国别省市：日本;JP