一种茶树菇菌种低温保藏及解冻方法技术

本发明专利技术公开了一种茶树菇菌种低温保藏及解冻方法，其特征在于其包括如下步骤：（1）菌种低温保藏：取茶树菇液体菌种0.5ml，加入1ml的60%浓度的甘油和0.5ml的1%浓度的黄原胶作为保护液，或加入1ml的60%浓度的甘油和0.5ml的20%浓度的甘露醇作为保护液，‑20℃液体管冷冻保藏；（2）解冻：取冻存种，立即放入35‑40℃的水中，摇晃快速解冻，然后转入GPY固体培养基，25‑28℃恒温培养。本发明专利技术保持茶树菇菌种活力高、不退化、操作简便、价格低廉、设备要求低、占据空间小、易于推广。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及一种茶树菇菌种低温保藏及解冻方法，涉及微生物菌种保藏

技术介绍
：茶树菇（Agrocybeaegirit）属担子菌门、担子菌纲、粪锈伞科、田头菇属，属中温型食用菌；含有人体所需的18种氨基酸，营养丰富，蛋白含量高，脂类及糖类含量低，保健疗效明显；而且，茶树菇所含营养价值超过多种其他食用菌，属高档食用菌类，具有补肾滋阴、健脾胃的作用；目前茶树菇栽培面积较大，一些地区的日产量达万斤以上；目前对于茶树菇功能及栽培方法有一定的研究，但对其菌种保藏研究较少。面对如此大规模的栽培面积，菌种保藏工作显得尤为重要，高效廉价的菌种保藏方式，有利于产业健康稳定发展。目前常用的菌种保藏方式为液氮超低温保存、冷冻干燥保存、石蜡油保存、试管斜面传代保存等。液氮超低温保存、冷冻干燥保存方法虽然效果良好，但其需要良好的设备及技术，投入过高，不适合在企业推广；石蜡油保存、试管斜面传代保存方法虽然简单、廉价，但保存时间短，每隔一段时间就得重新转管、传代，这对于遗传稳定性较高的菌株影响不大，但对于遗传稳定性较差的菌株则影响很大，会由于保藏时间长及转接次数过多导致培养基缩水、染菌、菌种退化，而且这两种方法占用空间体积大，需要配备较多的冷藏设备空间。液体管冻存方法操作简单、占用空间面积小、保藏时间长，但却并不适用于所有食用菌菌种保藏。许多食用菌菌种冷冻会致死。液体管冻存分为-20℃冻存（普通家用冰箱）和-70℃冻存（超低温冰箱）两种。超低温冰箱冻存效果更好，但设备价格价格昂贵，在企业极少配备；而家用冰箱价格低廉，企业单位普遍配备。所以研究菌种的-20℃液体管冷冻保藏方法，更有推广价值。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于克服上述已有技术的不足而提供一种保持茶树菇菌种活力高、不退化、操作简便、价格低廉、设备要求低、占据空间小、易于推广的茶树菇菌种低温保藏及解冻方法。本专利技术的目的可以通过如下措施来达到：1、一种茶树菇菌种低温保藏及解冻方法，其特征在于其包括如下步骤：（1）菌种低温保藏：取茶树菇液体菌种0.5ml，加入1ml的60%浓度的甘油和0.5ml的1%浓度的黄原胶作为保护液，或加入1ml的60%浓度的甘油和0.5ml的20%浓度的甘露醇作为保护液，-20℃液体管冷冻保藏；（2）解冻：取冻存种，立即放入35-40℃的水中，摇晃快速解冻，然后转入GPY固体培养基，25-28℃恒温培养。为了进一步实现本专利技术的目的，其包括如下步骤：（1）菌种低温保藏：①茶树菇液体菌种的培养：无菌条件下，挑取黄豆粒大小茶树菇试管种，接种于GPY液体培养基中，GPY液体培养基的配方组分以g/L计为:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-28℃、160rpm恒温培养8-10天；②保护液的制备：1%浓度的黄原胶：准确称取1g黄原胶固体，溶于100ml水中，121℃，灭菌30min；60%浓度的甘油：准确量取60ml甘油，加水定容至100ml；20%浓度的甘露醇：准确称取20g甘露醇，溶于100ml水；③超净工作台内，采用无菌操作，用移液枪分别在2ml冻存管中加入1ml的60%浓度的甘油和0.5ml的1%浓度的黄原胶作为保护液，或加入1ml的60%浓度的甘油和0.5ml的20%浓度的甘露醇作为保护液，然后加入准备好的茶树菇液体菌种0.5ml；④将准备好的冻存管菌种放入冻存盒，置于-20℃冷冻保藏；（2）解冻：①取出冻存的茶树菇菌种，立即放入35-40℃的恒温水浴锅中，摇晃快速解冻，直到全部解冻为止，尽量减少形成的冰晶对细胞的伤害；②取0.5ml保藏菌种，无菌操作移至GPY固体培养基上25-28℃恒温培养，观察测定菌丝生长状况。本专利技术同已有技术相比可产生如下积极效果：1．采用-20℃低温冷冻保藏法，通过加入保护剂低温进行冷藏。其所需设备条件及操作程序远远低于液氮冷藏，只需一台普通冰箱就可完成。2．通过筛选保护液及其浓度后，将保护液与菌种混合，放置于-20℃保存即可，不需要补充液氮，也不用像传代培养一样定期活化，保藏方法简便易行，价格低廉，非常适合应用于普通科研单位及广大生产单位。3．保藏于2ml冻存管中，占用保藏体积小，一个一百平方厘米的冻存盒能装一百个冻存管。4．可以按盒分类，用时取出一管，管理方便。5．保存时间2年以上，不需要定期传代，减少染菌及菌种退化的几率。6．采用1%浓度的黄原胶作为保护液，黄原胶为微生物产生的生物大分子，无毒，易于降解，来源广泛。具有快速吸水能力，吸收细胞外的水分，增加粘度，使菌液悬浮，减少冰晶的形成，同时使形成的刺状冰晶尖端变钝，从而降低细胞外水分低温形成的冰晶刺破细胞的几率；降低溶液中电解质浓度，减少溶质损伤；黄原胶是由微生物荚膜产生，对于微生物本身具有保护作用，且其受pH、盐等条件影响较小。研究表明，黄原胶在温度升高到120℃时，其粘度仅下降3%，非常适合保藏过程中的高温灭菌环节。黄原胶来源广泛，价格便宜，保存效果好。7.甘油作为常见的保护剂，来源广泛，较多的应用于菌种保藏领域，效果良好；将甘油和黄原胶或甘露醇混合使用作为保护剂，其保藏效果好于单纯用甘油作为保护剂条件下的保藏效果，且价格相对较低。8．所用培养基及温度等培养条件，均为试验后得出的结果，适合茶树菇菌丝生长。具体实施方式：下面对本专利技术的具体实施方式作详细说明：实施例1：（1）菌种低温保藏：①茶树菇液体菌种的培养：无菌条件下，挑取黄豆粒大小茶树菇试管种，接种于GPY液体培养基中，GPY液体培养基的配方组分以g/L计为:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-28℃、160rpm恒温培养8-10天。②保护液的制备：60%浓度的甘油：准确量取60ml甘油，加水定容至100ml；1%浓度的黄原胶：准确称取1g黄原胶固体，溶于100ml水中，121℃，灭菌30min；③超净工作台内，采用无菌操作，用移液枪分别在2ml冻存管中加入0.5ml的1%浓度的黄原胶和1ml的60%浓度的甘油作为保护液，然后加入准备好的茶树菇液体菌种0.5ml。④将准备好的冻存管菌种放入冻存盒，置于-20℃冷冻保藏。（2）解冻：①取出冻存的茶树菇菌种，立即放入35-40℃的恒温水浴锅中，摇晃快速解冻，直到全部解冻为止，尽量减少形成的冰晶对细胞的伤害。②取0.5ml保藏菌种，无菌操作移至GPY固体培养基上25-28℃恒温培养，观察测定菌丝生长状况。实施例2：（1）菌种低温保藏：①茶树菇液体菌种的培养：无菌条件下，挑取黄豆粒大小茶树菇试管种，接种于GPY液体培养基中，GPY液体培养基的配方组分以g/L计为:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-28℃、160rpm恒温培养8-10天。②保护液的制备：60%浓度的甘油：准确量取60ml甘油，加水定容至100m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种茶树菇菌种低温保藏及解冻方法，其特征在于其包括如下步骤：（1）菌种低温保藏：取茶树菇液体菌种0.5ml，加入1ml的60%浓度的甘油和0.5ml的1%浓度的黄原胶作为保护液，或加入1ml的60%浓度的甘油和0.5ml的20%浓度的甘露醇作为保护液，‑20℃液体管冷冻保藏；（2）解冻：取冻存种，立即放入35‑40℃的水中，摇晃快速解冻，然后转入GPY固体培养基，25‑28℃恒温培养。

【技术特征摘要】
1.一种茶树菇菌种低温保藏及解冻方法，其特征在于其包括如下步骤：
（1）菌种低温保藏：取茶树菇液体菌种0.5ml，加入1ml的60%浓度的甘油和0.5ml的1%浓度的黄原胶作为保护液，或加入1ml的60%浓度的甘油和0.5ml的20%浓度的甘露醇作为保护液，-20℃液体管冷冻保藏；
（2）解冻：取冻存种，立即放入35-40℃的水中，摇晃快速解冻，然后转入GPY固体培养基，25-28℃恒温培养。
2.根据权利要求1所述的一种茶树菇菌种低温保藏及解冻方法，其特征在于其包括如下步骤：
（1）菌种低温保藏：
①茶树菇液体菌种的培养：
无菌条件下，挑取黄豆粒大小茶树菇试管种，接种于GPY液体培养基中，GPY液体培养基的配方组分以g/L计为:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-28℃、160rpm恒温培养8-10天；
②保护液的制备：
1%浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘静，孙磊，程显好，李维焕，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37