人轮状病毒毒种ZTR-18毒株及其分离，培养及鉴定制造技术

本发明专利技术涉及人轮状病毒毒种毒株的分离、培养和鉴定。具体来说是人轮状病毒毒种ZTR-18毒株，已于2015年9月27日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）提交保藏，编号：11288。本发明专利技术提供了人轮状病毒毒种ZTR-18毒株的分离、培养和鉴定方法，人轮状病毒毒种ZTR-18毒株可用于生产减毒型轮状病毒口服疫苗及灭活型人轮状病毒注射疫苗。

Human rotavirus strain ZTR-18 and isolation, culture and identification of the strain

The invention relates to the isolation, culture and identification of a human rotavirus virus strain. Specifically, the human rotavirus ZTR-18 strain has been submitted to the general microbiological Center (CGMCC) of the Chinese microbiological preservation Management Committee on 27 September 2015. The number is: 11288. The present invention provides a method for isolation, culture and identification of human rotavirus ZTR-18 strain virus, human rotavirus strain ZTR-18 strain can be used for the production of attenuated rotavirus vaccine and inactivated human rotavirus vaccine.

【技术实现步骤摘要】
人轮状病毒毒种ZTR-18毒株及其分离，培养及鉴定
本专利技术涉及轮状病毒，尤其是人轮状病毒毒种毒株的分离、培养和鉴定。
技术介绍
灭活轮状病毒疫苗是一种安全有效地预防儿童因感染轮状病毒所引起疾病的疫苗。但至今仍未有灭活轮状病毒疫苗产品上市。目前临床前研究或投放市场的轮状病毒疫苗均为口服减毒活疫苗，减毒活疫苗尽管有一定效果，但在安全性方面存在缺陷，例如引发肠套叠和毒力回复突变及产生新的变异株的风险；以及冷链保存系统要求费用高，因此，研制安全、有效的灭活轮状病毒疫苗不仅在避免减毒活疫苗使用中存在的问题方面具有优势，也为未来研制联合疫苗提供基础。综上所述，研制灭活轮状病毒疫苗具有重要意义及应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种人源性轮状病毒野生型单一纯化毒株，该毒株病毒复制能力强，遗传稳定性好；该毒种可应用于开发人用轮状病毒疫苗的生产毒种，适用包括减毒型轮状病毒口服疫苗及灭活型人轮状病毒注射疫苗；并提供上述毒株的分离、培养和鉴定方法。本专利技术公开了一种人轮状病毒毒种毒株，其特征在于为人轮状病毒毒种ZTR-18毒株，已于2015年10月16日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）提交保藏，编号：11288，分类命名：轮状病毒RotavirusA。本专利技术所涉及ZTR-18毒株的分离方法：（1）获取病毒样本收集医院儿科腹泻病患幼儿腹泻排泄物标本，重悬于0.01MPBS，pH7.2溶液中，12000g离心20分钟取上清液，并使用0.22μm滤器除菌过滤，-20℃保存备用；（2）ZTR-18毒株病毒在MA104细胞上的适应采用0.25%胰酶-EDTA消化已形成单层的P64代MA104细胞，待细胞经消化形成单个后，以DEME-8%BCS重悬细胞，稀释至105.0细胞/ml，按2×105.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天后，将轮状病毒感染的患儿腹泻样本稀释液200μl接种于细胞单层，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，至3～4天出现细胞病变后，收获培养物后继续同法接种MA104细胞传代或冻存备用；在本专利技术的轮状病毒分离方法中，通过改良传统轮状病毒分离方法，采用11300×g离心30分钟取上清液，并采用100K超滤膜包浓缩15倍体积，获得较高的病毒回收得率和除杂效果，37℃培养并观察细胞病变，改善了轮状病毒初代培养效率。本专利技术所涉及ZTR-18毒株的培养方法：（1）ZTR-18毒株病毒在Vero细胞上的适应：采用0.25%胰酶-0.01%EDTA消化已形成单层的P148代Vero细胞，并以DMEM-8%BCS重悬细胞，按105.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天至形成致密细胞单层后，接种原MA104细胞收获的病毒液1ml，接种量约为105.0～106.0CCID50/ml，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，收获培养物后继续同法接种Vero细胞传代或冻存备用；本专利技术涉及的轮状病毒培养及制备方法是基于传统病毒型疫苗毒种制备的方法进行适应于新基因型人轮状病毒的改良。本专利技术所涉及ZTR-18毒种的鉴定方法：（1）ZTR-18毒株病毒滴度测定：取毒种10倍系列稀释，接种MA104单层细胞进行病毒PFU滴定，按105.0细胞/1000μl/孔加入MA104细胞至6孔培养板，37℃培养3～4天细胞生长为致密单层，加入10倍系列稀释的毒种，每个稀释度2个孔，37℃吸附1小时后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，加入1.0%琼脂糖凝胶，37℃培养3天，加入1.0%含0.02mg/ml终浓度的中性红琼脂糖凝胶，37℃继续倒置培养4天，观察结果；（2）中和鉴别实验：将分离毒株病毒抗血清按梯度稀释后，100μl/孔接入96孔平底组织培养板，加入梯度稀释的收获病毒，37℃CO2孵箱中和1小时后，按104细胞/100μl/孔加入经消化悬浮的Vero细胞，37℃CO2孵箱中培养8～10天，观察结果；（3）ZTR-18毒株病毒基因组核酸及逆转录、cDNA质粒构建：病毒基因组的核酸提取按TAKARAMiniBEST病毒基因组RNA提取试剂盒操作手册进行，病毒基因RNA逆转录使用TAKARAOneStepRT-PCR试剂盒，按操作手册进行，并根据A组轮状病毒G3型基因型全基因序列设计合成针对11个RNA片段的11对引物，并分段以RT-PCR方法获得11个cDNA基因片段，克隆入pMD19-T载体中，逐一进行测序；本专利技术涉及的轮状病毒毒种鉴定方法是基于传统病毒型疫苗毒种制备的方法进行适应于人轮状病毒的改良。其中病毒滴度的检测方法改良PFU检测方法。附图说明图1电子显微镜下的轮状病毒形态。图2部分腹泻病例排泄物轮状病毒基因组PAGE电泳检测。图3分离毒株ZTR-18在MA104细胞上传代培养情况。图4正常MA104细胞及分离毒株ZTR-18在细胞上的病变情况，图中a:正常MA104细胞，b:ZTR-18毒株在MA104细胞上的病变。图5分离毒株ZTR-18传代PAGE基因组电泳图。图6ZTR-18毒株传代RT-PCR扩增轮状病毒特异性VP7基因电泳图。具体实施方式实施例1、如图1-6所示1、ZTR-18毒株的分离方法：（1）获取病毒样本收集医院儿科腹泻病患幼儿腹泻排泄物标本，重悬于0.01MPBS，pH7.2溶液中，12000g离心20分钟取上清液，并使用0.22μm滤器除菌过滤，-20℃保存备用；（2）ZTR-18毒株病毒在MA104细胞上的适应采用0.25%胰酶-EDTA消化已形成单层的P64代MA104细胞，待细胞经消化形成单个后，以DEME-8%BCS重悬细胞，稀释至105.0细胞/ml，按2×105.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天后，将轮状病毒感染的患儿腹泻样本稀释液200μl接种于细胞单层，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，至3～4天出现细胞病变后，收获培养物后继续同法接种MA104细胞传代或冻存备用；在本专利技术的轮状病毒分离方法中，通过改良传统轮状病毒分离方法，采用11300×g离心30分钟取上清液，并采用100K超滤膜包浓缩15倍体积，获得较高的病毒回收得率和除杂效果，37℃培养并观察细胞病变，改善了轮状病毒初代培养效率。2、ZTR-18毒株的培养方法：（1）ZTR-18毒株病毒在Vero细胞上的适应：采用0.25%胰酶-0.01%EDTA消化已形成单层的P148代Vero细胞，并以DMEM-8%BCS重悬细胞，按105.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天至形成致密细胞单层后，接种原MA104细胞收获的病毒液1ml，接种量约为105.0～106.0CCID50/ml，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，收获培养物后继续同法接种Vero细胞传代或冻存备用；本专利技术涉及的轮状病毒培养及制备方法是基于传统病毒型疫苗毒种制备的方法进行适应于新基因型人轮状病毒的改良。3、ZTR-18毒种的鉴定方法：（1）ZTR-18毒株病毒滴度测定：取毒种10倍系列稀释，接种MA104单层细胞进行病毒PFU本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人轮状病毒毒种毒株，其特征在于为人轮状病毒毒种ZTR‑18毒株，已于2015年10月16日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）提交保藏，编号：11288，分类命名：轮状病毒 Rotavirus A。

【技术特征摘要】
1.一种人轮状病毒毒种毒株，其特征在于为人轮状病毒毒种ZTR-18毒株，已于2015年10月16日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）提交保藏，编号：11288，分类命名：轮状病毒RotavirusA。2.如权利要求1所说的人轮状病毒毒种ZTR-18毒株的分离方法，其特征在于具体如下：（1）获取病毒样本收集医院儿科腹泻病患幼儿腹泻排泄物标本，重悬于0.01MPBS，pH7.2溶液中，12000g离心20分钟取上清液，并使用0.22μm滤器除菌过滤，-20℃保存备用；（2）ZTR-18毒株病毒在MA104细胞上的适应采用0.25%胰酶-EDTA消化已形成单层的P64代MA104细胞，待细胞经消化形成单个后，以DEME-8%BCS重悬细胞，稀释至105.0细胞/ml，按2×105.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天后，将轮状病毒感染的患儿腹泻样本稀释液200μl接种于细胞单层，37℃吸附2小时，随后加入不含小牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养并观察细胞病变，至3～4天出现细胞病变后，收获培养物后继续同法接种MA104细胞传代或冻存备用。3.如权利要求1所说的人轮状病毒毒种ZTR-18毒株的培养方法，其特征在于具体如下：（1）ZTR-18毒株病毒在Vero细胞上的适应：采用0.25%胰酶-0.01%EDTA消化已形成单层的P148代Vero细胞，并以DMEM-8%BCS重悬细胞，按105.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3～4天至形成致密细胞单层后，接种原MA104细胞收获的病毒液1ml，接种量约为105.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鸿钧，孙茂盛，吴晋元，周艳，张光明，易山，尹娜，解裕萍，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53