一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法技术

本发明专利技术涉及一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法。本发明专利技术涉及的ST细胞全悬浮培养的工艺，其关键技术在于ST细胞全悬浮驯化成功后可在生物反应器进行猪伪狂犬病病毒HZ株的大规模培养，具有操作简单、可控性强、培养效率和自动化程度高、不需要载体等优势，为细胞或疫苗的规模化生产提供了一条新的路径。

【技术实现步骤摘要】
一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法
本专利技术涉及一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
猪伪狂犬病是由猪的伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的一种猪急性传染病。猪伪狂犬病病毒可以感染不同年龄段的猪，但以妊娠母猪和哺乳仔猪感染最为严重：导致妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎；哺乳仔猪出现神经症状、麻痹、衰竭死亡，死亡率几乎高达100％。(邓仕伟，汪勇，薛春芳。我国伪狂犬病流行现状及新特点.动物医学进展，2006,27(9)：105-107)(TambaM,CalabreseR,FinelliE,etal.RiskfactorsforAujeszky’s-diseaseseropositivityofswineherdsofaregionofnorthernItaly.PrevVetMed,2002,54(3):203-212)。我国于上世纪70年代从匈牙利引进了PRVBartha-K61株，该病毒株是公认的优良疫苗株，上世纪90年代以来国内规模化猪场普遍使用该疫苗进行防治，对猪伪狂犬病起到了很好的控制作用。但是，自2011年以来，在我国华北、华中、华东、东北等地区的许多使用基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场出现了疑似猪伪狂犬病的流行，发病猪场数量多，损失较大，主要表现为猪群gE抗体阳性率显著升高，母猪产弱仔、死胎，仔猪出现神经症状及死亡等。通过对发病猪群组织器官中PRV病毒的序列分析及致病性研究，科学家发现猪伪狂犬病病毒的抗原性发生了一定程度的变异，变异伪狂犬毒株对猪的致病性更强。(赵鸿远等.猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及其gE基因的分子特征.中国预防兽医学报，1008-0589(2014)07-0506-04)。ST细胞，即猪睾丸细胞，属于成纤维细胞，体外可连续传代贴壁培养，该细胞系对多种病毒敏感，如：猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒等，是疫苗生产中繁殖病毒的主要原辅材料之一。ST细胞培养是病毒类疫苗生产的关键工艺环节，直接影响到疫苗的质量，如何稳定获得足量的细胞对于保证生产能力和产品质量尤为重要。转瓶培养ST细胞技术是目前兽用病毒类疫苗生产中使用最为普遍的细胞培养方法，优势是工艺简单、成本低廉，然而生产效率低、劳动强度高、产品均一度差等问题一直很难从根本上得以解决。(陈文庆,王建超,刘华杰等.悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的比较分析[J].中国兽药杂志,2010,44(10):37-41)。基于转瓶培养的弊端，悬浮培养开始应用于生产实际之中。ST细胞悬浮培养工艺可控制一系列细胞培养参数，具有培养病毒含量高，无须混合，批间差异小，培养方式自动化，无须大量生产人员，培养需求面积小、污染小、成本低等优点，且避免了BVDV等外源病原污染，是疫苗制备中首选的细胞培养技术。目前悬浮培养应用主要是微载体悬浮培养。全悬浮培养在兽用疫苗方面，率先应用于口蹄疫疫苗的生产，之后悬浮培养工艺在生物制药行业引发一定的效应，疫苗生产企业越来越关注新工艺。本申请人在为猪场提供疾病诊断的过程中，从送检病料中分离到一株gE基因自然缺失的变异株弱毒HZ株。我们用HZ株作为制苗用毒株，在对HZ株进行安全性、免疫原性等研究的基础上，尝试了ST细胞全悬浮生产猪伪狂犬疫苗的工艺。该工艺关键技术在于细胞驯化，ST细胞全悬浮驯化成功后，可用于猪伪狂犬病毒的培养。较其它微载体悬浮培养系统，该系统具有操作简单、可控性强、培养效率和自动化程度高、不需要载体等优势，为细胞或疫苗的规模化生产提供了一条新的路径。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种ST细胞全悬浮生产猪伪狂犬病疫苗的工艺，从而降低生产成本，进行规模化、均一性生产，以应对目前国内猪伪狂犬病毒病流行形势。本专利技术的技术方案1.一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于其制备方法包括细胞培养、更换细胞培养液并接毒和收获工序，即先将ST细胞用摇瓶进行悬浮培养扩增后接入生物反应器进行悬浮培养，当细胞生长至病毒接种密度后更换一部分细胞培养液并接入病毒种子液，在生物反应器内继续培养至结束后收获病毒液，加入适宜的冻干保护剂混匀分装后经真空冻干而成。2.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于所述更换细胞培养液并接毒工序为使用ST细胞在生物反应器中悬浮培养至可接毒状态时，将细胞培养液的1/3换成新的细胞培养液，并接种猪伪狂犬病病毒。3.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产伪狂犬病病毒的方法，其特征在于所述方法具体为：(1)将ST细胞用摇瓶悬浮培养48h～72h后离心，用细胞培养液将经离心的细胞再悬浮后以密度3×105～3×106/ml接入生物反应器，进行ST细胞全悬浮培养；(2)待ST细胞全悬浮培养至密度为6×105/ml～6×106/ml，生物反应器15℃沉降2小时，泵出上层1/3的原培养液注入新的细胞培养液，并按照体积比1％～5％接种伪狂犬病病毒种毒；(3)在生物反应器中继续培养悬浮细胞，待80％左右的细胞出现典型CPE时，收获病毒液，加入适宜的冻干保护剂混匀后分装，经冷冻真空干燥制成疫苗。4.如权利要求1-3所述一种使用全悬浮技术生产伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于所述的病毒为保藏号为CGMCCNo.11912的伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus)HZ株。5.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病的方法，其特征在于所述ST细胞株的建立，是由猪睾丸传代细胞(ST细胞系)经贴壁培养阶段的低血清驯化过程和低血清培养液悬浮驯化过程而获得，该株细胞被命名为猪睾丸细胞系(Porcinetestis)悬浮适应株，简称ST-1株。该株细胞已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.12698。以上本专利技术所述的细胞培养液系指低血清细胞培养液，其血清含量(V/V)为0.5％～2％。使用的细胞生物反应器为APPLIKON公司30L～2000L细胞生物反应器。本专利技术公开的ST细胞全悬浮培养猪伪狂犬病疫苗的工艺，其操作简单、可控性强、培养效率和自动化程度高、不需要载体，可以在低血清培养基中悬浮培养，为细胞或疫苗的规模化生产提供了一条新的路径。具体实施方式一、全悬浮培养的ST细胞株的建立驯化过程1.ST细胞贴壁培养阶段的驯化(降低血清)：从液氮罐中取ST贴壁细胞种子(CVCC，No.CL27，购自中国兽医药品监察所，中国微生物菌种保藏管理中心，见《中国兽医菌种目录》(第二版)，p171))，在T75培养瓶中加入10％新生牛血清的细胞生长液，进行ST细胞复苏，并贴壁培养，使用逐步降低血清的贴壁培养基进行传代培养驯化。血清含量从10％、8％、5％、3％、2％、1％降至0.5％。2.ST细胞(低血清培养基)的悬浮驯化将驯化成功的ST细胞F39的一部分收获，并冻存，记为ST-1F0。ST细胞驯化过程可以看出，该细胞在贴壁阶段血清含量由10％降至低血清水平(0.5％～2％)，细胞的数量和活力均能达到实验要求。而从贴壁到悬浮，通过39代的驯化培养，细胞才能适应悬浮培养状态，并能稳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于其制备方法包括细胞培养、更换细胞培养液并接毒和收获工序，即先将ST细胞用摇瓶进行悬浮培养扩增后接入生物反应器进行悬浮培养，当细胞生长至病毒接种密度后更换一部分细胞培养液并接入病毒种子液，在生物反应器内继续培养至结束后收获病毒液，加入适宜的冻干保护剂混匀分装后经真空冻干而成。

【技术特征摘要】
1.一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于其制备方法包括细胞培养、更换细胞培养液并接毒和收获工序，即先将ST细胞用摇瓶进行悬浮培养扩增后接入生物反应器进行悬浮培养，当细胞生长至病毒接种密度后更换一部分细胞培养液并接入病毒种子液，在生物反应器内继续培养至结束后收获病毒液，加入适宜的冻干保护剂混匀分装后经真空冻干而成。2.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于所述更换细胞培养液并接毒工序为使用ST细胞在生物反应器中悬浮培养至可接毒状态时，将细胞培养液的1/3换成新的细胞培养液，并接种猪伪狂犬病病毒。3.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产伪狂犬病病毒的方法，其特征在于所述方法具体为：(1)将ST细胞用摇瓶悬浮培养48h～72h后离心，用细胞培养液将经离心的细胞重悬后以密度3×105～3×106/ml接入生物反应器，进行ST细胞全悬浮培养；(2)待ST细胞全悬浮培养至密度为6×105/ml～6×106/ml，生物反应器...

【专利技术属性】
技术研发人员：张连秀，巩志宏，闵庆如，周忠涛，于宗幸，
申请(专利权)人：齐鲁动物保健品有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37