大肠杆菌荧光PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种采用实时荧光PCR方法特异性检测样品中大肠杆菌核酸存在的试剂盒。利用本发明专利技术的试剂盒，可快速检测样品中是否存在大肠杆菌核酸，该试剂盒对大肠杆菌核酸的检测限为10拷贝每反应体系，整个反应可在2小时内完成，在疾病监测、临床诊断等领域具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种采用实时荧光PCR方法特异性检测样品中大肠杆菌核酸的试剂 盒，属于大肠杆菌的体外诊断领域。
技术介绍
大肠杆菌(E. co 1 i )为革兰氏阴性短杆菌，是埃希氏菌属的代表菌，一般不致病，是 人和动物肠道中正常的栖居菌;在一定条件下可引起肠道外感染，肠道外感染以泌尿道感 染最多见，常由一些特殊血清型的大肠埃希菌所致(如01、02、04、06、011、015、及017等血清 型），它们大多数能产生溶血素，在机体抵抗力降低、外伤或大肠埃希菌离开肠道侵入组织 器官时，引起多种化脓性感染，甚至导致内毒素休克。 某些血清型的大肠杆菌可引起人类腹泻:肠产毒性大肠埃希菌可引起婴幼儿和旅 游者出现轻度腹泻，也可呈严重的霍乱样症状，为自限性，一般2-3天自愈;肠致病性大肠埃 希菌是婴幼儿腹泻的主要病原菌，有高度传染性，成人少见;肠出血性大肠埃希菌可引起散 发性或爆发性出血性肠炎。 在检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学 检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测的特异性和 敏感性的基础。 本专利技术分别针对大肠杆菌基因序列的保守区域特异的靶序列设计引物和Taqman 探针，利用real-time PCR的方法，用来快速检测样品中是否存在大肠杆菌的核酸。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是快速准确地检测样品中是否存在大肠杆菌，提供一 种特异性检测大肠杆菌的荧光PCR试剂盒。 本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的： 一种特异性检测样品中大肠杆菌核酸的试剂盒，组分包括PCR反应液、酶混合液、阴性 质控品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有上述的引物和探针、反应缓冲液、Mg2+和dNTP 等，酶混合液主要含有热启动Taq酶，阴性质控品为无 RNase和DNase水，阳性质控品为含有 大肠杆菌检测靶序列的重组质粒。 PCR反应液中用于核酸扩增的引物为P1和P2，P1和P2为针对大肠杆菌基因组群特 异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物;PCR反应液中用于荧光信号监测的寡 核苷酸探针为ProbeUProbel为针对大肠杆菌基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛 选出的特异性探针，其中荧光报告基团Χι为CY5,荧光淬灭基团YiSBHQ(见表1)。 表1检测大肠杆菌的引物和探针序列Probel | 5'-Xi-CGGGCCATACGCCGCAATACGCA -Υι 本专利技术的另一个目的是提供本荧光PCR检测试剂盒在检测大肠杆菌的应用方法，包括： 试剂盒选用的PCR反应体系为20 μL，包括2XPCR缓冲液10 yUlOmmol/L dNTP 1.0 μ 1、25_〇1/1引物各0.5 yUlOymol/L探针0.2 μL、热启动Taq酶混合液0.4 μL、样品DNA 2μ 1，加灭菌水至终体系20 μL。 试剂盒的PCR反应循环参数为94°C，2min;进入循环阶段:94°C变性10s，56°C退火 50s，72 °C延伸15s，共反应40个循环。 质量控制:每次实验应设立阴、阳性对照，阴性对照无 Ct值(或Ct值为0)，阳性对照 Ct值< 30，否则实验结果不成立。 结果判读： 阳性：出现"S"型扩增曲线，Ct值< 35;可疑：出现"S"型扩增曲线，但Ct值> 35;阴性:没 有出现"S"型扩增曲线，或者曲线虽然超过了阈值，但不呈"S"型;对可疑结果，应重复实验， 如果重复实验还是出现"S"型扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。 样本要求：临床样本类型包括患者粪便、肛拭子、呕吐物和分离培养物；临床样本 采集后应带冰运输，-20°C保存，不能反复冻融;从临床样本提取DNA，建议采用性能稳定可 靠的商品化试剂盒，具体方法参见相应商品化试剂盒说明书，提取的DNA应立即检测，否则， 应将DNA分装后-80°C~_20°C保存。 本专利技术提供的试剂盒具有很好的特异性，可以检出大肠杆菌，但不能检出非大肠 杆菌病原体的核酸;对大肠杆菌核酸的检测下限为10拷贝每反应体系；只需要2小时即可完 成检测，可为大肠杆菌的疾病监测和临床诊断提供实验依据。【附图说明】 图1为单重实时荧光PCR检测大肠杆菌阳性标准品的扩增曲线图。从左至右的每组 曲线对应浓度依次为2 X 106-2X 102C〇pieSAil，试剂盒对大肠杆菌的检测限为10拷贝每反 应体系。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的A Rn值。 图2为单重实时荧光PCR检测体系检测10种细菌基因组DNA的扩增曲线图。10种细 菌包括:大肠杆菌和9种阴性对照微生物。大肠杆菌出现S型扩增曲线，而其他9种病原微生 物未出现S型扩增曲线。【具体实施方式】 下面结合具体实施例详细说明本专利技术的优选实施方式。需要指出的是，这里列出 的实施例仅仅为示例性说明的目的，而不应将其解释为对本专利技术范围的任何限制。其中使 用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人 员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本专利技术的目的。引物和TaqMan探针的设计与合成 利用Blast工具对Genbank和国内外文献中的大肠杆菌基因组序列进行分析，分别选择 其稳定的保守区域作为检测靶序列。大肠杆菌检测靶序列为碱性磷酸酶基因；并针对检测 靶序列设计和合成引物和探针(见表1)。引物和探针均由日本TaKaRa大连宝生物公司合成， 大肠杆菌的检测探针5 '端标记CY5荧光基团；3 '端标记BHQ荧光淬灭基团。 检测菌种的准备 本实施例中所使用的大肠杆菌以及其他阴性对照菌株(伤寒沙门菌，肠炎沙门菌，小肠 结肠炎耶尔森菌，土拉弗朗西斯菌，肺炎克雷伯菌，痢疾志贺菌，福氏志贺菌，流感嗜血杆 菌，鲍氏志贺菌)均购买于中国药品生物制品检定所。 菌株DNA的抽提 选用Qiagen公司QIAamp DNA Mini Kit(货号：51306)提取菌株DNA。具体步骤试剂盒参 考当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于特异性检测样品中大肠杆菌核酸的试剂盒，其中包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品；PCR反应液中用于核酸扩增反应的引物序列如下：P1：5`‑ CGAAGAGGATTCACAAGAACATAC ‑3`，P2：5`‑ GGTCTGGTCGGTCAGTCCAA ‑3`，PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针的序列如下：Probe：5`‑X1‑CGGGCCATACGCCGCAATACGCA ‑Y1 ‑3`，Probe荧光报告基团X1为CY5，荧光淬灭基团Y1为BHQ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：江苏和创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32