一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法技术

一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，其特征是利用细胞内特异表达的靶标microRNA分子作为催化剂，催化金纳米粒子-量子点组装体的去组装反应，重复利用单个microRNA分子将多个QD与GNP进行解离，使预先被猝灭的QD荧光信号恢复并被多级放大，从而实现对活细胞内靶标microRNA分子的高灵敏度检测与成像，并以此作为区分肿瘤细胞和正常细胞的依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分析化学、纳米材料等领域，具体涉及一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，具体包括活细胞内microRNA分子催化金纳米粒子与量子点之间的去组装反应，改变GNP与QD之间的荧光共振能量转移效应，对QD的荧光信号进行放大，从而实现对活细胞中靶标microRNA分子高特异性和高灵敏度的检测方法，并以此实现对肿瘤细胞和正常细胞的准确区分。
技术介绍
量子点（quantumdots，英文简称QDs）是一种尺度小于或者近似激子波尔粒径的半导体纳米晶体。相比于传统的有机分子染料，其具有独特且优异的光学性质，比如激发谱宽且连续分布，发射波长可调，荧光量子产率高，荧光寿命长，抗光漂白性强等，因而在生物标记成像、光电子器件，光伏太阳能材料等领域具有广泛的应用前景。QDs独特的荧光性质使得其能够作为荧光共振能量转移效应的理想供体；同时由于高效的表面等离子共振效应和对可见波段光谱的强烈吸收性能，金纳米粒子（英文简称GNP）能够作为荧光共振能量转移效应的理想受体。DNA分子是遗传信息的载体，其由于Watson-Crick碱基互补配对原则而具有可编程性；以toe-hold（中文名叫立足点，它是DNA链取代反应中需要的条件）介导的DNA链取代反应，可以实现DNA双链与单链之间有序的取代反应。以含有PS段（即磷硫键，P-S）和PO段（即磷氧键，P-O）的DNA作为模板分子来合成量子点的方法，不仅能够简单而直接地对QD表面进行DNA共价偶联修饰，还能够通过调节PS段的长度以及量子点的粒径大小来精确控制量子点表面的DNA分子的数量；同时外部的PO段仍处于自由伸展状态，保持着DNA的可编程性。同样，由于巯基（-SH）与Au原子之间强烈的共价键结合能力，修饰了-SH的DNA分子能够轻易地被修饰到GNP的表面，所修饰的DNA分子同样保持着可编程性。因此，上述方法所获得的DNA修饰的QD和GNP，可以通过DNA分子实现程序化地可控地自组装并形成具有高效荧光共振能量转移效应的GNP-QD纳米组装体。MicroRNA是一类关键的非编码性微小RNA分子，其对于细胞中基因表达有着重要的调控作用。MicroRNA的非正常表达往往跟多种疾病，特别是肿瘤的发生发展有着密切的关联。因此对microRNA的特异性和高灵敏度的检测将具有十分重要的意义。现有的microRNA分子的检测方法，主要集中于体外检测，包括聚合酶链式反应（即PCR）和分子信标（即MolecularBeacon）的方法。体外检测首先要求将microRNA分子从细胞中提取出来。然而提取过程不仅耗时耗力，也往往会对原有的microRNA分子产生污染，如提取过程的效率问题往往导致获得的microRNA分子的浓度少于细胞中的实际值；或者因为核酸酶的影响，使得microRNA分子在提取过程中被部分降解等。因此发展一种在活细胞中直接的、特异性和高灵敏度的microRNA分子的检测方法将会具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，解决了目前microRNA分子的检测方法提取过程效率低、灵敏度不够高的问题。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，包括以下步骤：第一步，通过DNA3将修饰有DNA1的GNP和修饰有DNA2的QD通过DNA碱基互补配对规则进行程序化地组装，获得GNP-QD纳米组装体，所述DNA1和DNA2均能够与DNA3进行碱基互补配对，所述DNA1含有至少一个巯基，所述DNA2含有磷硫键；在组装体中，由于QD与GNP之间的高效荧光共振能量转移效应，QD本身的荧光性能被暂时淬灭；其中，所述GNP的粒径范围为5nm~100nm；所述QD的发射波长范围从450nm~750nm；第二步，用脂质体将所述GNP-QD纳米组装体和DNA4一起转染到活细胞中共培养，DNA4能够与DNA3进行碱基互补配对；之后，在活细胞中表达的靶标microRNA分子的催化作用下，所述GNP-QD纳米组装体发生催化去组装，使GNP与QD相分离，此时由于QD与GNP之间的荧光共振能量转移效应消失，QD本身的荧光信号获得恢复，细胞能够发出荧光；所述靶标microRNA分子为活细胞中任意高表达的microRNA分子；第三步，通过细胞的荧光成像，实现对靶标microRNA分子的特异性和高灵敏的定性检测。上述技术方案中的有关内容解释如下：1、上述方案中，较佳的方案是所述QD的成分选自CdTe、CdSe、CdS二元量子点中的任意一种，或选自ZnHgSe、CdHgSe、ZnInS、ZnCdSe合金量子点中的任意一种，或选自CdSe/ZnS、ZnSe/ZnS、CdTe/ZnS核壳型量子点中的任意一种，在或者选自单质量子点Si、P、C中的任意一种。2、上述方案中，所述DNA1和DNA2都是单链DNA，并且均能与DNA3进行碱基互补配对，以此，DNA3将修饰有DNA1的GNP和修饰有DNA2的QD组装起来。3、上述方案中，由于活细胞中microRNA分子数量很少，而进入到活细胞中的GNP-QD纳米组装体数量较多，因此microRNA只能进行有限次的反应，microRNA只能与GNP-QD纳米组装体按照摩尔比为1:1进行反应，加入了DNA4就可以使microRNA进行循环放大反应，也就是说重复利用单个microRNA分子将多个QD与GNP进行解离，使预先被猝灭的QD荧光信号恢复并被多级放大。4、上述方案中，所述脂质体的作用是主要是用来转染DNA4-1。脂质体是一个比较成熟的商品化试剂，用来向活细胞中转染外界物质，常常用作基因转染。在上述方案中，主要借助它来转染DNA4，因为单独的DNA4是不能进入到细胞的。当然脂质体也可以将GNP-QD转入细胞，所以GNP-QD的转染不仅能依靠自身具有的转染特性，还能借助脂质体的转染作用，结果是GNP-QD的转染效率会大大增加。5、上述方案中，当GNP-QD组装体进入到不表达靶标microRNA分子的正常细胞中时，GNP-QD的去组装反应不会被诱发，QD不会从组装体上游离出来，其荧光不会恢复，细胞也不会发出荧光。本专利技术设计原理以及有益效果是：本专利技术在上述已有的技术基础上，提出了一种基于纳米组装体的催化放大去组装和QD荧光成像方法，实现在活细胞中直接的、特异性和高灵敏度的microRNA分子检测的方法。首先将修饰有DNA的GNP和QD通过DNA碱基互补配对规则进行程序化地组装，获得GNP-QD纳米...

【技术保护点】
一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：第一步，通过DNA3将修饰有DNA1的GNP和修饰有DNA2的QD通过DNA碱基互补配对规则进行程序化地组装，获得GNP‑QD纳米组装体，所述DNA1和DNA2均能够与DNA3进行碱基互补配对，所述DNA1含有至少一个巯基，所述DNA2含有磷硫键；在组装体中，由于QD与GNP之间的高效荧光共振能量转移效应，QD本身的荧光性能被暂时淬灭；其中，所述GNP的粒径范围为5 nm~100 nm；所述QD的发射波长范围从450 nm~750 nm；第二步，用脂质体将所述GNP‑QD纳米组装体和DNA4一起转染到活细胞中共培养，DNA4能够与DNA3进行碱基互补配对；之后，在活细胞中表达的靶标microRNA分子的催化作用下，所述GNP‑QD纳米组装体发生催化去组装，使GNP与QD相分离，此时由于QD与GNP之间的荧光共振能量转移效应消失，QD本身的荧光信号获得恢复，细胞能够发出荧光；所述靶标microRNA分子为活细胞中任意高表达的microRNA分子；第三步，通过细胞的荧光成像，实现对靶标microRNA分子的特异性和高灵敏的定性检测。...

【技术特征摘要】
1.一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以
下步骤：
第一步，通过DNA3将修饰有DNA1的GNP和修饰有DNA2的QD通过DNA碱基互补配对规则进
行程序化地组装，获得GNP-QD纳米组装体，所述DNA1和DNA2均能够与DNA3进行碱基互补配
对，所述DNA1含有至少一个巯基，所述DNA2含有磷硫键；在组装体中，由于QD与GNP之间的高
效荧光共振能量转移效应，QD本身的荧光性能被暂时淬灭；其中，所述GNP的粒径范围为5
nm~100nm；所述QD的发射波长范围从450nm~750nm；
第二步，用脂质体将所述GNP-QD纳米组装体和DNA4一起转染到活细胞中共培养，DNA4
能够与DNA3进行碱基互补配对；之后，在活细胞中表达的靶标microRNA分子的催化作用下，...

【专利技术属性】
技术研发人员：马楠，何学文，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32